外殼蛋白ε在非小細胞肺癌中作用的探索

谷潤川，楊雄濤，王國輝，許長丹，葛舒童，王昊，高立偉*

（1.中日友好臨床醫(yī)學研究所，北京 100029；2.昌平區(qū)醫(yī)院 腫瘤科，北京 102200；3.天津市第一中心醫(yī)院 放射治療科，天津 300100；4.北京大學中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029；5.中日友好醫(yī)院 放射腫瘤科，北京 100029）

肺癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率第二、死亡率高居榜首，在中國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計數據中均居首位[1，2]，其中非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）最常見，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是NSCLC 中最常見的病理類型[3]。免疫球蛋白G樣蛋白，也稱唾液酸化免疫球蛋白G（sialylated-Immunoglobulin-G，SIA-IgG），在多種腫瘤組織均表達，我組前期工作發(fā)現，SIA-IgG 是ⅢA 期LUAD 患者術后放療的獨立預后因素并促進放射抵抗[4]。

在對SIA-IgG 的相互作用蛋白進行探索時發(fā)現外殼蛋白ε（coatomer subunit epsilon，COPE）與SIA-IgG 結合，結合量受射線照射影響。COPE 是外殼蛋白的7個組成亞單位之一（ε亞基），其他還有α-COP、β-COP、β'-COP、γ-COP、δ-COP、ε-和ζ-COP[5]。該復合體高度保守，并參與蛋白質在細胞內的運輸[6]。研究發(fā)現，COPE 功能缺陷細胞中COPE 降解增多，并在不低于37℃環(huán)境中引發(fā)多種內吞和分泌缺陷[7]。此外，COPE 還參與中樞神經脈絡叢炎癥，豬細小病毒感染等過程[8]。現有文獻對COPE 與NSCLC 的關系鮮有報道。本研究用免疫沉淀聯合液相質譜分析COPE 與SIA-IgG的結合，并對COPE 在NSCLC 中的作用進行探索，研究設計思路見圖1。

圖1 研究設計路線圖

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng)及照射

NSCLC 細胞系PC9 和H292（10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基）于37℃、5%CO2培養(yǎng)，取對數生長期的細胞，Varian 醫(yī)用直線加速器照射（6MV，X 線，6Gy，300cGy/min）并迅速放回孵箱中，依實驗需要處理。

1.2 免疫沉淀-液相質譜分析

取照射后2h、6h、12h、24h、36h、72h 細胞洗滌并加入適量含抑制劑的裂解液，冰上裂解5～10min 后刮下至離心管，13000rpm 4℃離心15min，取上清，加入適量RP215（北京大學醫(yī)學部免疫系邱曉彥教授課題組饋贈）4℃過夜。加入適量Protein A&G 磁珠室溫孵育1h。磁分離、洗滌并洗脫。將所得樣品送至北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院質譜中心分析。

1.3 COPE的泛癌表達情況分析

在Kaplan Meier Plotter 在線數據分析平臺（https：//kmplot.com/analysis/），以“COPE”為探針檢索并分析TCGA（The Cancer Genome Atlas）、GEO（Gene Expression Omnibus）以及EGA（European Genome-phenome Archive）數據庫中多種不同來源腫瘤組織中COPE 的表達情況（以正常肺組織中COPE的表達水平作為對照）。

1.4 COPE在肺腺癌與肺鱗癌中的表達情況分析

在TCGA 數據庫以“l(fā)ung adenocarcinoma”和“l(fā)ung squamous cell carcinoma”為檢索詞獲取肺腺癌和肺鱗癌腫瘤組織RNAseq數據（level3）及臨床信息。在GTEx（genotype-tissue expression）數據庫中以相同策略檢索并獲取正常組織測序信息作對照，將數據分為LUAD 組、LUSC 組及Normal組，用R（v4.0.3，以下省略）boxplot 繪制箱線圖，Kruskal Wallis檢驗腫瘤與正常肺組織COPE差異情況（α=0.05）。

1.5 COPE與SIA-IgG表達情況驗證

在GEO中篩選包含COPE和IGHG1表達信息且同時包含腫瘤測序信息和正常肺測序信息的數據集，log2 化處理后用normalize.quantiles 標準化。將探針I(yè)D 轉化為gene symbol 并剔除可同時匹配多個基因的探針I(yè)D。用remove Batch Effect 去批次效應，ggord 繪制PCA 圖作質控，boxplot 繪制箱線圖，Wilcox 檢驗COPE 與IGHG1 的差異（α=0.05）。

1.6 免疫組化對比分析

在HPA 數據庫以“COPE”為檢索詞檢索并查閱正常肺和肺腫瘤組織COPE 免疫組化檔案。選同型號抗體染色的正常肺、肺腺癌和肺鱗癌免疫組化圖進行分析。HPA 數據庫中已將免疫組化樣本分為高、中、低、未見，本研究對不同分組進行秩和檢驗判斷差異（α=0.05）。

1.7 臨床意義評估

根據TCGA 數據庫中COPE 表達中位值分為高低兩組，用R 對2 組T、N、M 分期及性別、種族、吸煙史、新腫瘤類型進行分析，ggplot2 繪圖，χ2檢驗組間差異（α=0.05）。在Kaplan-Meier Plotter 平臺選擇“auto-cut-off”和單因素分析方法對肺腺癌和肺鱗癌患者的生存信息進行cox 分析，繪制生存曲線（α=0.05）。

1.8 機制探索

收集TCGA 數據庫中細胞增殖、凋亡、DNA 損傷修復、DNA 復制通路和腫瘤炎癥通路中的基因表達信息及COPE表達信息，用GSVA包進行統(tǒng)計分析，選擇參數“method=‘ssgsea’”，Spearman法分析相關性（α=0.05）。

2 結果

2.1 COPE 與SIA-IgG 結合，并在受到射線照射后升高

SIA-IgG 免疫沉淀聯合液相質譜分析實驗發(fā)現，照射后2h、6h、12h、24h、36h、72h 不同時間點免疫沉淀樣本中均檢出COPE（表1，表2），照射后COPE 含量上升，12h/24h 達峰后回落，照射后COPE 與SIA-IgG 的結合量呈時間依賴性變化（圖2A，2B）。

圖2 SIA-IgG免疫沉淀聯合液相質譜分析結果

表1 H292細胞照射后不同時間點免疫沉淀樣本COPE分析結果

表2 PC9細胞照射后不同時間點免疫沉淀樣本COPE分析結果

2.2 COPE在NSCLC中的表達情況

COPE 的表達在包括肺腺癌和肺鱗癌在內的大多數腫瘤組織中均上調，僅在少數腫瘤中下調（圖3A、3B，見封二），3 個相互獨立的GEO 數據集中COPE 在腫瘤組織中的表達均上調且與SIAIgG 的表達正相關（圖3C～3E，見封二）。正常肺組織與NSCLC 組織COPE 免疫組化結果也顯示NSCLC 組織中COPE 表達升高（圖3F、3G，見封二）。

圖3 NSCLC中COPE的表達情況分析

2.3 COPE與NSCLC患者臨床特征及預后的關系

高表達COPE 的肺鱗癌患者與低表達COPE的患者相比，T1 期與N1 期患者比例顯著降低（圖4A、4B）。在M 分期（圖4C）、臨床分期（圖4D）、性別（圖4G）、種族（圖4H）、新發(fā)腫瘤類型性別（圖4E）及是否吸煙（圖4F）方面暫不能認為2 組構成有顯著差異。盡管如此，高表達COPE 的肺腺癌和肺鱗癌患者預后相較于低表達組均顯著下降（圖4I）。

圖4 NSCLC中COPE的表達情況與臨床特征及預后關系的分析

2.4 COPE與NSCLC中部分已知信號通路相關蛋白印跡的關系

對TCGA 數據庫中肺腺癌和肺鱗癌COPE 表達情況與多種已知的信號通路蛋白印跡進行相關性分析，發(fā)現COPE 的表達量與已知具有促腫瘤效應的腫瘤增殖通路相關蛋白、DNA 復制相關蛋白、DNA 損傷修復相關蛋白和MYC基因通路相關蛋白印跡均顯著正相關（圖5A～5D），同時與已知具有抗腫瘤效應的細胞凋亡通路相關蛋白印跡和腫瘤組織炎癥反應相關蛋白印跡顯著負相關（圖5E、F）。

圖5 NSCLC中COPE與多種已知通路相關性Spearman檢驗圖

3 討論

肺癌是目前人類健康的主要威脅[1，2]。隨著各種治療手段的發(fā)展，早期NSCLC 患者預后顯著改善，放療療效已經與手術治療無顯著差別[9]。但腫瘤放射抵抗及復發(fā)仍存在，單純提升劑量無法真正改善預后，放療增敏才是未來方向。上世紀末，邱教授團隊發(fā)現SIA-IgG 在多種腫瘤組織均存在并促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[10]，其表達與多種腫瘤標志物相關[11]，可能成為預后指標[12]，其機制與ROS 通路、FAK 通路、SOX2 等有關[13，14]，并參與腫瘤細胞干性維持[15]。腫瘤微環(huán)境中SIA-IgG 可抑制T 細胞浸潤[16]。我組前期工作發(fā)現，SIA-IgG 是ⅢA 期LUAD 患者術后放療的獨立預后因素并促進放射抵抗。

在對SIA-IgG 互作蛋白進行探索時，我們發(fā)現COPE 與SIA-IgG 結合，且結合量在照射后呈時間依賴性改變。現有文獻對COPE 與NSCLC 的關系研究鮮有報道，本研究首次發(fā)現COPE 與SIAIgG 結合且在受照射后結合增多。對COPE 在NSCLC 中作用及潛在機制的系統(tǒng)性探索發(fā)現了COPE 在NSCLC 分期和不良預后方面的價值，推測了COPE 促進腫瘤發(fā)生發(fā)展和放射抵抗的機制，為今后的深入研究提供了明確的思路和方向。

我們先通過細胞照射、免疫沉淀聯合液相質譜分析技術，發(fā)現了COPE 與SIA-IgG 的結合且COPE 的量在照射后上升。細胞在受到照射后往往會啟動多種促生存機制以實現最終的細胞存活[17]，而COPE 在此時升高提示COPE 可能發(fā)揮促腫瘤效應，COPE 與SIA-IgG 的結合及同步升高更支持了COPE 促腫瘤效應的猜想。依托數據庫的大量NSCLC 樣本進行的生物信息學分析發(fā)現，NSCLC 中COPE 高表達并與SIA-IgG 的表達正相關，與更高的T、N分期和不良預后相關，這支持了COPE 促腫瘤效應的猜想，同時揭示了COPE 對NSCLC預后預測的價值。

本研究中對COPE 與一些已知信號通路的相關性研究發(fā)現，COPE 與腫瘤增殖通路、DNA 復制、DNA 損傷修復和MYC通路相關基因的表達正相關，與細胞凋亡通路和腫瘤炎癥反應相關基因的表達負相關。這提示COPE 的促腫瘤效應可能通過促進腫瘤細胞的增殖和DNA 的損傷修復實現，鑒于與之結合的SIG-IgG 有促腫瘤效應和促放療抵抗效應，二者可能協(xié)同促進DNA 的損傷修復和放射抵抗，削弱放療效果。COPE 的抗炎及抗凋亡效應也可促進腫瘤的生存和免疫逃逸。

本研究通過免疫沉淀聯合液相質譜分析技術發(fā)現COPE 與SIA-IgG 結合，這一方法雖然具有可信度，但在后續(xù)研究中仍可考慮進行western blotting 實驗和免疫熒光共定位加強論證。對COPE的探索主要依托數據庫和生物信息學，可信度較好，但屬描述性研究，尚缺乏干預實驗的支持，后續(xù)研究中可考慮補充。總結來說，本研究發(fā)現了COPE 與SIA-IgG 的結合并在射線照射后增多，分析明確了COPE 在NSCLC 中的表達情況和臨床價值，初步探索了COPE 促腫瘤效應的潛在機制，為后續(xù)基礎實驗驗證提供了思路與支持，填補了COPE與NSCLC關系這一空白，為COPE在腫瘤檢測和治療方面的應用提供了依據與方向。