納米粒子作用于小膠質細胞以減少腦缺血再灌注損傷的機制分析

鄭榮泉 尹浩

缺血性腦卒中是腦血管病中的急危癥,具有較高的致殘率和死亡率。大約80%的腦卒中是由于栓子或血栓阻塞血管導致部分大腦循環突然中斷［1］。目前針對缺血性腦卒中的治療在于早期實現再灌注以挽救缺血半暗帶中受損的神經元［2］。然而,再灌注會導致炎癥反應引起的繼發性組織損傷,稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)［3］。目 前臨床上控制炎癥以治療CIRI 的策略并不令人滿意,而NP 能夠克服大腦中的生物障礙,為缺血性腦卒中治療提供了一個新的方向。

1 腦卒中

CIRI 是一個多細胞參與的復雜的級聯反應,病理生理過程復雜,包括自由基氧產生［如O2-和過氧化氫(H2O2)］、能量代謝障礙、細胞Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性、線粒體損傷、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)大量合成、氧化應激、多巴胺和神經細胞凋亡有關,此外,炎癥細胞因子上調,內皮細胞被激活,免疫細胞從循環系統遷移到腦組織［3-5］。炎癥反應在CIRI 中起關鍵作用［6］。小膠質細胞(microglia,MG)被認為是炎癥反應的關鍵細胞［7］。有文獻報道MG 行為與疾病嚴重性相關［8］。

2 MG

2.1 MG 概述 目前認為MG 來源于造血系統的原始造血干細胞產生的巨噬細胞［9］。MG 是中樞神經系統(central nervous system,CNS)內固有的免疫細胞,約占腦實質的10%［10］,具有免疫和炎癥的多重功能,也具有吞噬作用,能夠清除病原體或受損的神經元。作為CNS 的第一道免疫防線［11］,在腦內穩態和腦疾病的神經保護中發揮重要作用［12］,任何原因引起腦內環境紊亂都可激活MG。MG 過度激活導致炎癥反應是許多神經系統疾病發生的關鍵［13］。

2.2 MG 與炎癥反應 MG 活化指其形態學的變化,在正常腦組織中,由于受神經元抑制作用,MG 呈分枝狀,不斷巡邏CNS 實質以維持CNS 的穩態,此時的MG 為靜息狀態。當損傷或疾病發生時,失去了抑制作用,MG 迅速被激活,激活后呈阿米巴樣,即活化狀態,活化后的MG 作為CNS 中的定植炎癥細胞參與炎癥反應和免疫應答［14］。

中樞神經炎癥反應是由MG 激活及細胞因子和炎癥介質釋放所引起的。活化的MG 被認為是CNS 中多種神經毒性因子的來源,如活性氧(ROS)。MG 的激活是一個復雜的過程,會受到許多物質和周圍微環境的影響。MG 一旦受到干擾,就會被激活并將鄰近的MG和(或)外周巨噬細胞募集到損傷部位［15］。在不同的病理階段,MG 與其他細胞類型(如神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和內皮細胞)動態相互作用并受其影響。因此,MG 的反應是可變的,并且會隨著中風后的時間而變化［11］。

MG 可以在表型上極化為兩種主要表型：“經典激活”M1 和“替代激活”M2。M1 型MG 是促炎反應,其特征是表達CD86,CD16 和CD32 等；產生各種炎癥介質,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-β(IFN-β)和白細胞介素-23(IL-23)等各種趨化因子和炎癥因子,來清除病原體和受損細胞,但過多的釋放炎癥介質,如NO、氧自由基等也會引起促炎和和細胞毒性,損傷正常神經細胞,加重神經損傷。相比之下,M2 型被視為“修復細胞”,M2 型MG 表達精氨酸酶-1 (Arg-1),CD206 和類胰島素一號增長因子(IGF-1)等。分泌抗炎介質,如促進組織修復的白細胞介素-4(IL-4),白細胞介素-10(IL-10)以及一些神經營養因子如神經生長因子(nerve growth factor,NGF)等營養因子促進損傷神經的修復與再生,從而抑制炎癥反應并促進組織再生。此外,與M2 型MG 相比,M1 型MG雖然能夠促進神經突觸再生,但卻有神經毒性作用,Ml型更傾向于誘導神經元死亡。M1/M2 細胞的比例失調有助于CIRI 后腦炎癥反應發生［16,17］。

已有研究表明,在CIRI 后第0～3 天,活化的MG被募集到梗死周圍區域并動態極化短暫的抗炎和保護性M2 表型［16］。M2 型MG 早在缺血后1 h 就被迅速激活,在受損組織中釋放的腺苷三磷酸(ATP)分子。然而,MG 易受缺氧環境影響,如果缺血持續時間超過MG 耐受閾值,MG 就會在缺血核心死亡。在缺氧條件下,MG 釋放促炎細胞因子,如白細胞介素-8(IL-8)和TNF-α,并最終經歷缺氧誘導因子-1α (HIF-1α) 依賴性自噬細胞死亡［10］。CIRI 后第3～14 天,M2 表型被逆轉為持續的促炎和有害M1 表型,促炎性M1 表型在第3 天迅速增加,并在CIRI 的第1 周內占據梗死周圍區域［16］。M2 型主要出現在早期,損傷后3～5 d 開始逐漸向M1 型轉變,這種轉變將會持續到第14 天。MG的這種動態變化過程對腦損傷的研究與治療有著重要的意義。因此,了解MG 在CIRI 過程中的作用及機制,可能為CIRI 治療提供新的策略。

3 CIRI 與NP

目前缺血性腦卒中的治療局限,雖然改善循環、營養神經等治療方法有效,但對于再灌注所引起的急性腦損傷效果不理想［18］。近些年來,隨著納米技術的快速發展,納米粒子(nanoparticles,NP)可以有效逆轉缺血性腦卒中再灌注引起的損傷。大多數機制是NP具有延長血液循環時間、降低清除率、提高血腦屏障(BBB)滲透能力和增強腦積聚［19］。減輕神經炎癥已成為改善預后的有效輔助療法［20］。減輕炎癥的主要方法有兩種：減少從血液滲入損傷部位的炎癥細胞和抑制病灶部位的炎癥細胞活化和增殖［21］。

BBB 和炎性內皮細胞對于中風治療中的藥物遞送和炎性細胞浸潤都至關重要［22］。特別BBB 是阻止治療藥物進入CNS 的主要障礙［6］。缺血性腦卒中會在短時間內(幾分鐘到幾小時)啟動BBB 開放,然后在較長時間內(幾小時到幾天)再次重新開放。缺血區域的再灌注(血液供應的恢復)對于減少腦損傷至關重要,同時也可能導致再灌注損傷,導致BBB 重新開放［23］。

3.1 NP 作為藥物載體與藥物納米化 NP 因其體積小、無毒、生物降解性、非免疫原性、在生物系統中持續釋放藥物的能力和在炎癥區域積聚的傾向而被認為是最有效的藥物傳遞載體［24］。許多藥物之所以無效或療效不佳,是因為它們沒有靶向輸送到患病區域。為了解決這一問題,納米技術靶向給藥成為一種有效的治療方法。納米技術可以根據不同的目的修飾或模仿生物活性,允許藥物高效和按需釋放到靶向區域,最大限度地發揮藥物的治療效果,同時最大限度地減少副作用［25］。最近,一些研究表明,以NP 為載體的復合藥物可以改善缺血性腦卒中的治療。不同的NP 配方可以增加CNS 藥物的生物利用度。例如：聚乙二醇化NP、聚合物NP、不同類型的脂質NP［8,26］。適當的細胞內轉運治療藥物又是另一個難題,但NP 可以利用MG 中現有的內吞途徑進行內化。由于MG 在激活狀態下吞噬行為的增加,MG 是藥物遞送的有效細胞靶標。量子點 (QD) 和聚酰胺胺(PAMAM)樹枝狀聚合物等NP 具有MG 特異性藥物遞送［8］。藥物的納米化可以增加其飽和溶解度,據報道,納米懸浮液制劑可以提高生物利用度。因此,以納米晶體的形式制備低溶解度藥物或化合物的能力為藥物治療和藥物傳遞提供了一個新的范式［26］。

3.2 NP 抗炎、抗氧化作用及NP 成像 NP 還具有抗炎、抗氧化作用。納米技術介導的抗氧化治療已被證明是一種很有前途的治療氧化損傷引起的疾病的方法,氧化鈰、金NP 等均得到證實［19］。目前治療腦部疾病的一個新興模式是將治療和診斷藥物共同輸送到目標部位,同時幫助監測治療藥物的有效性,但挑戰在于確定成像和治療藥物的理想組合,這種組合能夠協同作用,并確保它們共同輸送到受影響的區域,克服強大的BBB。正是在這種背景下,以納米技術為基礎的干預具有重要意義。利用納米尺度載體系統,同時將影像和治療劑通過BBB 送到受影響的部位,對于腦卒中的治療來說是一個新前景［27］。

4 MG 與NP

4.1 抑制MG 極化和促進M1 轉化為M2 控制MG的激活狀態和直接抑制促炎因子是預防缺血性中風引起的損傷的潛在干預措施［17］。MG 功能與其表型密切相關,如能抑制MG 激活,特別是M1 型MG,能減輕或抑制炎癥反應,減少腦損傷。阿奇霉素(AZ)可以抑制病理性MG 激活以應對缺血性中風損傷。Joseph 等［8］設計了聚苯乙烯-聚乙二醇(PS-PEG)納米顆粒遞送AZ,通過納米顆粒運載到達中樞抑制MG 的激活來減輕炎癥反應。姜黃素具有抗炎和抗氧化作用,姜黃素可以抑制活性氧形成,減少炎癥損傷,但姜黃素水溶性差和化學性質不穩定,在很大程度上限制了其生物醫學應用。Wang 等［28］研究了包裹姜黃素的納米顆粒(NPcurcumin) 可以提高姜黃素的穩定性,延長其在體內的循環時間。通過降低BBB 通透性保護BBB 和抑制M1 型MG 激活并減弱了TNF-α 和白細胞介素-1β(IL-1β)的分泌來減少缺血半暗帶中的氧化應激和炎癥,從而減少了梗死面積和改善功能恢復。Liu 等［29］研究發現一定濃度金NP(Au-NPs)可提高了抗炎細胞因子的產生,并抑制了CIRI 誘導的星形膠質細胞和M1型MG 的激活,抗凋亡蛋白表達上調,促凋亡分子表達下調,可顯著改善神經功能缺損和梗死體積,其神經保護作用主要是由于其抗炎和抗凋亡作用。

促進MG 從M1 極化到M2(抗炎型)可以減弱炎癥反應并挽救受損的神經元,這也是近年來研究的熱點［2,30］。有文獻報道一些小分子藥物,如芬戈莫德(FTY),可以促進MG 向M2 型極化［2］。Li 等［2］制備了一種裝載芬戈莫德(FTY)的巨噬細胞封裝的蜂窩狀二氧化錳(MnO2) 納米球。FTY 通過靜電相互作用封裝在MnO2納米顆粒中,通過激活信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3) 通路促進MG 的表型轉變,從而逆轉促炎微環境。Mujagi? 等［30］研究氮氧自由基(4-氨基-TEMPOL)偶聯納米粒子(RNPs,抗氧化納米藥物),與 TEMPOL 相比,它們的直徑為30 nm,靜脈注射后半衰期長60 倍。RNPs 能抑制BBB 破壞并支持MG 極化為M2 型MG,提高ROS 清除能力,從而提高了存活率和神經功能缺損。

4.2 抑制MG 增殖 對于已經存在于大腦中的MG,當務之急是削弱它們在原位的功能和增殖。例如,雷帕霉素(RAP)可以顯著減少巨噬細胞和MG 產生的促炎細胞因子和趨化因子［22］。Wang 等［22］報道了一種單核細胞膜包被雷帕霉素納米粒子(McM/RNPs),McM/RNPs 可以主動靶向并結合炎癥內皮細胞,抑制單核細胞與內皮細胞的粘附,從而起到屏障的作用。隨后,McM/RNPs 可以穿透內皮到達損傷部位,釋放雷帕霉素(RAP)藥物抑制MG 的增殖,起到緩解炎癥的作用。

4.3 抑制MG 功能 MG 是CNS 中補體成分C3 的重要局部來源,而C3 在CIRI 后的MG 神經毒性中起核心作用。MG 在 CIRI 損傷發生后的幾分鐘內迅速粘附、遷移并進入半暗帶,并誘導大量 C3 在半暗帶內沉積。反過來,沉積的C3 會進一步加劇MG 的激活并放大炎癥級聯反應,導致神經元損傷。此外,C3 被切割成抗微生物肽C3a 和調理素C3b。C3b 在附近神經元表面的沉積導致其與MG 上的補體受體3 (CR3)結合,從而增加神經元的MG 吞噬作用。Wang 等［31］制備了裝載C3-siRNA 的納米碳化硅。該NP 可以有效地將C3-siRNA 從血液中穿過BBB 傳遞到缺血半暗帶,并顯著降低MG 和缺血腦組織中C3 的表達,減少了神經元上的C3b 沉積并減少了MG 介導的神經元損傷,阻止神經元凋亡,減少缺血區的體積,顯著改善CIRI 損傷后的功能恢復。

4.4 監測活化MG 由于活化MG 分泌促炎和抗炎因子和其他分子介質,導致炎癥反應。如果能采用非侵入性方法在體內識別活化MG 就可以更早地檢測到神經炎癥,并提供一種監測疾病進展和治療干預的方法。目前,大多數活化MG 成像探針主要設計用于正電子發射斷層掃描(PET)和目標易位蛋白,這些蛋白也存在于其他腦細胞上。獲得的PET 圖像并不特定于MG 驅動的炎癥。Tang 等［7］設計了一種潛在的PET/MRI 多模式成像探針-硫酸化葡聚糖包被的氧化鐵(SDIO)NP,它選擇性地靶向活化MG 表達的清道夫受體A 類(SR-A),SDIO 被MG 迅速吸收,在小鼠模型中靜脈注射時顯示無毒性。SDIO 顯著增強了對比度,而使用非靶向NP 或未使用NP 的動物對比度幾乎沒有變化。因此,SR-A 定位代表了一種很有前途的策略,可以對大腦中激活的MG 進行成像。進行無創成像的能力將為研究和臨床應用提供有價值的信息。

綜上所述,缺血性腦卒中的發生難以預料且癥狀嚴重。目前臨床上治療方法僅有溶栓使血管再通效果顯著,重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓治療是目前主要治療方法,但仍存在許多問題,包括時間窗窄、半衰期短、rt-PA 誘導再灌注和氧化損傷等。納米技術的發展為腦再灌注損傷提供新的治療方法。目前NP 用于抑制MG 活化。抑制MG 活化并不是完全抑制其活性,而是通過抑制M1 型的過度激活,從而抑制炎癥因子、細胞毒性因子的釋放,達到調節M1/M2平衡的作用,從而使MG 的激活向改善神經炎癥的方向發展,達到緩解或治療疾病的效果。保護神經元不受損壞也是治療CIRI 的研究熱點和方向。現階段作為治療腦卒中的NP 仍在研究當中,尚存在諸多問題,包括NP 的毒性、體內代謝過程等。不過,NP 用于治療腦再灌注損傷是一個很有前景的治療方法。