丙泊酚對孕鼠妊娠晚期睡眠剝奪后子代大鼠海馬區JAK2/STAT3 信號通路及神經炎癥的影響

徐思源 呂靖 魏瓊 金青青 肖靜 李清

人類每日需要睡眠,睡眠不足會影響人類健康,降低機體免疫力,增加患病風險。尤其對于妊娠期女性,睡眠剝奪的發生率大大增高［1］。隨之而來的是睡眠剝奪對其造成的多種不良影響,相關研究發現,妊娠期間MSD 不僅可增加孕婦自身高血壓、糖尿病、產后抑郁、早產等患病風險,還可對子代造成多種不良影響［2,3］。有研究指出孕鼠MSD 會引發子代海馬區神經炎癥及損傷子代認知功能［4］。但具體機制尚不明確,因此有必要進一步探究其相關機制。JAK2/STAT3 通路的激活與炎癥密切相關。其參與多種炎癥過程且與腦損傷有關。丙泊酚作為臨床上廣泛應用的靜脈麻醉藥物,不僅有鎮靜作用,還有抗炎、抗氧化等非麻醉作用［5,6］。因此本篇文章通過建立孕鼠MSD 模型,探討丙泊酚對孕鼠MSD 后子代大鼠海馬區及神經炎癥的影響及與JAK2/STAT3 通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究獲得了湖北醫藥學院動物護理與使用委員會的批準。本研究選用孕18 d SD 大鼠,所有孕鼠均來自湖北醫藥學院實驗動物中心,丙泊酚注射液購自中國阿斯利康制藥有限公司、JAK2 抗體、p-JAK2 抗體、STAT3 抗體、p-STAT3 抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司,GAPDH 抗體購自美國Proteintech Group 公司,ELISA 試劑盒購自欣博盛公司,裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5X)購自中國碧云天公司,蛋白酶、磷酸酶抑制劑購自瑞士Roche 公司、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒購自中國Servicebio 公司,電泳裝置、凝膠成像分析系統、酶標儀購自美國Bio-Rad 公司,組織勻漿機購自江蘇友聯儀器研究所,低溫高速離心機購自德國Eppendorf,水迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及藥物處理 將12 只孕18 d SD 大鼠按照隨機數字表法分為：對照組(Con 組)、睡眠剝奪組(MSD 組)、睡眠剝奪+丙泊酚組(MSD+Pro組),每組4 只。本實驗采用水平臺睡眠剝奪法對孕鼠睡眠剝奪。水平臺設備為自制水平臺睡眠剝奪箱,箱內放置4 個平臺,孕鼠可于平臺間自由活動,每個平臺直徑為6.5 cm,使用時剝奪箱內注入清水至距平臺1 cm 處,保證箱內水溫于25℃,孕鼠可自由獲得水和食物。從MSD 組及MSD+Pro 組分別隨機選取1 只孕鼠進行為期72 h 的睡眠剝奪,睡眠剝奪后將孕鼠放回原籠中飼養待產,待其產出子代7 d 后行相應處理。向MSD+Pro 組新生7 d SD 大鼠腹腔內注射20 mg/kg 丙泊酚［7］,注射完成后使其仰臥于動物電熱毯上,動態監測大鼠血氧飽和度,密切觀察其呼吸頻率及皮膚顏色確保無缺氧情況發生,待其翻正反射恢復后第2 日清晨,依據隨機數字表法每組選取5 只新生大鼠,喂養至第31 天,行水迷宮實驗。其余新生大鼠安樂死后取海馬組織行其他檢測。

1.2.2 蛋白質印跡定量分析 各組分別于冰上迅速取出3 只安樂死大鼠大腦并剝離取出海馬組織。海馬組織稱重后加裂解液經研磨機研磨后靜置、離心。取上清,加入對應上樣緩沖液,在100℃下煮沸10 min,得到蛋白樣本進行電泳。通過電泳裝置將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜)上。室溫下用5%脫脂牛奶將膜封閉1.5 h。封閉后,將膜與目標一抗置于4℃冰箱孵育過夜。第二日晨使用TBST 緩沖液清洗3 次膜后用山羊抗兔或山羊抗鼠二抗在室溫下孵育1.5 h,再次使用TBST 緩沖液洗膜3 遍后應用Western blot 凝膠成像分析系統對膜進行拍照和分析。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 各組分別于冰上迅速取出5 只安樂死大鼠大腦病剝離出海馬組織,用預冷的PBS 緩沖液沖洗海馬組織并用濾紙吸干表面水分,稱重后放入勻漿機中。每100 毫克海馬組織用1 ml 預冷的PBS 勻漿。5000 r/min 低溫離心10 min,取上清液。按照試劑盒說明書,測定海馬組織中促炎性細胞因子的含量。

1.2.4 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮是一項檢測實驗動物空間學習和記憶能力實驗。共有4 個象限：N,S,E,W。分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗進行4 d,提前1 d 對大鼠進行訓練,在訓練過程中,動物們被引導到一個隱藏的平臺,在測試階段記錄大鼠1～4 d 尋找隱藏平臺的時間。空間探索實驗在測試的第5 天進行,此時將平臺移除,將新生大鼠放于水中,使其不受干擾地游泳,記錄新生大鼠在目標象限內停留的時間和穿越平臺的次數。

1.3 觀察指標 比較各組子代大鼠Morris 水迷宮實驗結果,包括各組搜索平臺時間、穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比。比較各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達情況及海馬組織中促炎性細胞因子含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗,P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組子代大鼠Morris 水迷宮實驗結果比較MSD 組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時間明顯長于Con 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)；MSD+Pro組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時間明顯短于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組子代大鼠搜索平臺時間比較(,s)

表1 各組子代大鼠搜索平臺時間比較(,s)

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

MSD 組子代大鼠目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數均顯著低于Con 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)；MSD+Pro 組子代大鼠目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數均顯著高于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組子代大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比比較()

表2 各組子代大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比比較()

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

2.2 各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達情況比較 MSD 組子代安樂死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相對表達水平明顯高于Con組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相對表達水平明顯低于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖1,表3。

表3 各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達水平()

表3 各組子代安樂死大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達水平()

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

2.3 各組子代安樂死大鼠海馬組織中炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平比較 MSD 組子代安樂死大鼠炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平均明顯高于Con組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平均明顯低于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 各組子代安樂死大鼠海馬組織中炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平比較(,pg/ml)

表4 各組子代安樂死大鼠海馬組織中炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平比較(,pg/ml)

注：與Con 組比較,aP＜0.05；與MSD 組比較,bP＜0.05

3 討論

與妊娠早期女性相比,妊娠晚期女性睡眠質量更差、睡眠時間更短［8］。基于此,MSD 對子代的影響,已成為備受關注的問題。研究指出產前應激可損傷子代認知功能,影響子代身體發育［9］。因此本實驗通過構建妊娠晚期孕鼠睡眠剝奪(MSD)模型進一步研究MSD 對子代的影響。本次研究結果顯示：MSD 組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時間明顯長于Con 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD 組子代大鼠目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數均顯著低于Con組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD 組子代安樂死大鼠炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平均明顯高于Con 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。說明MSD 可損傷子代大鼠學習和記憶能力及導致子代大鼠海馬區神經炎癥。

丙泊酚是一種廣泛應用于成人及小兒麻醉的靜脈麻醉藥物。丙泊酚有多種麻醉優勢如起效快、蘇醒迅速等,它也具有多種非麻醉作用,其中包括抗炎、抗氧化、神經保護等［5,10］。研究指出丙泊酚可以減輕大鼠睡眠剝引起的學習記憶能力的降低及海馬區神經炎癥［11］。研究證明丙泊酚可減少異氟醚麻醉所致胚胎及子代小鼠海馬區炎性細胞因子IL-6 的釋放及改善其認知功能損傷［12］。但目前尚缺少丙泊酚與MSD 后子代大鼠的影響的相關研究。本次研究結果顯示：MSD+Pro 組子代大鼠于第3 天、第4 天搜索平臺時間明顯短于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代大鼠目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數均顯著高于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達水平均明顯低于MSD組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。說明丙泊酚可減少MSD 后子代大鼠的學習和記憶能力的損傷及減少子代大鼠海馬區神經炎癥,從而起到腦保護的作用。然而其相關機制尚不清楚。

JAK2/STAT3 信號通路是重要的信號轉導途徑,是介導多種免疫反應及炎性介質傳遞的信號轉導通路［13］。JAK2/STAT3 通路的激活可影響多種促炎性細胞因子的表達,如TNF-α、IL-6［14］。促炎性細胞因子IL-6 也可引發JAK/STAT3 通路的激活,致使T細胞分化從而激活小膠質細胞釋放更多促炎性細胞因子［15,16］。研究指出缺血性腦卒中后,位于小膠質細胞的STAT3 過度激活會加重小膠質細胞的激活和神經炎癥,且抑制JAK2/STAT3 通路的激活可減輕腦缺血損傷和神經炎癥［14,17］。本研究結果顯示：MSD 組p-JAK2、p-STAT3 相對表達水平明顯高于Con 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。MSD+Pro 組子代安樂死大鼠p-JAK2、p-STAT3 相對表達水平明顯低于MSD 組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。說明JAK2/STAT3 通路激活可介導MSD 后子代大鼠海馬區神經炎癥,且丙泊酚可抑制妊娠晚期孕鼠睡眠剝奪后所致子代大鼠海馬區JAK2/STAT3 信號通路的激活及神經炎癥的發生從而起到腦保護作用。

綜上所述,丙泊酚可抑制妊娠晚期孕鼠睡眠剝奪后所致子代大鼠海馬區JAK2/STAT3 信號通路的激活及神經炎癥的發生。本實驗研究了丙泊酚對孕鼠睡眠剝奪后對子代的影響及其可能相關機制。可為臨床上睡眠剝奪后新生子代麻醉提供一定參考,然而丙泊酚與MSD 后子代神經炎癥機制復雜,其具體機制尚需進一步研究。