柿葉水提物對(duì)高脂誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌損傷的改善作用及可能機(jī)制▲

姚姿羽 時(shí) 潔 陳子雯 王常清 覃鴻恩 周 輝

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院1 西藥房，2 中藥房，3 制劑室，湖北省恩施市 445000； 4 湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院西藥房，湖北省恩施市 445000)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大的變化，糖尿病的患病率也隨之升高[1]。目前，我國(guó)大約有1.14億糖尿病患者，防控形勢(shì)嚴(yán)峻[2]。隨著糖尿病病情的發(fā)展，腎臟及其他相關(guān)臟器的功能將會(huì)受到損傷，多組織器官的代謝發(fā)生異常[3-4]。柿葉含有黃酮類(lèi)化合物、有機(jī)酸、維生素等多種成分，具有降低血脂與血糖、增強(qiáng)免疫功能、增加冠狀動(dòng)脈血流量、擴(kuò)張血管等功效。有研究表明，柿葉提取物對(duì)糖尿病大鼠具有良好的降糖作用[5]。黃永洪等[6]的研究結(jié)果顯示，柿葉提取物可明顯減少心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重塑。但柿葉水提物是否可改善糖尿病相關(guān)性心肌損傷尚不清楚。本文旨在探討柿葉水提物對(duì)高脂誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌損傷的改善作用，并初步分析其作用機(jī)制，以期為糖尿病患者的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只無(wú)病原體級(jí)雄性昆明小鼠，6～8周齡，體重(30±2)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(鄂)2015—0018，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK(鄂)2017—0002。飼養(yǎng)條件：溫度為23 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每12 h晝夜交替，自由攝取食物及飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 柿葉水提取物購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院；常規(guī)飼料及D12492i高脂飼料購(gòu)自Research Diets,Inc.(批號(hào)：1905647)；HbA1c檢測(cè)試劑盒、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司(批號(hào)：20190584、20191073)；肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司(批號(hào)：2020021545、2020050237、2019120172、2020031582、2019110653、2020010922、2020031472)；蘇木素、伊紅、中性福爾馬林、酒精均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)：191005、200430、190801、200122)；iNOS、IL-10、GAPDH一抗購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司(批號(hào)：WL00992a、WL03088、WL01114)；山羊抗兔/鼠蛋白二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：A0208、A0216)。Sysmex Chemix-180型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自Furuno Electric公司；高精度型ONETOUCHⅡ血糖儀購(gòu)自強(qiáng)生公司；Mini-PROTEAN?Tetra蛋白電泳儀、Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad公司；C150凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于Azure Biosystems, Inc.。

1.3 建模及干預(yù)方法

1.3.1 分組及建模：將75只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組、模型組，以及低、中、高劑量柿葉水提物組，每組15只。除健康對(duì)照組外，其他各組小鼠采用D12492i高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)12周以建立糖尿病模型[7]。建模結(jié)束后，采集小鼠餐后2 h尾尖血用于檢測(cè)血糖，如血糖水平≥16.7 mmol/L，則可認(rèn)為成功建立糖尿病模型。健康對(duì)照組小鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.3.2 藥物干預(yù)：建模成功后，分別按10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg給予低、中、高劑量柿葉水提物組小鼠柿葉水提物灌胃，給予健康對(duì)照組和模型組小鼠等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥10 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.2 空腹血糖、HbA1c和FINS水平：完成體重、體長(zhǎng)測(cè)量后采集小鼠尾靜脈血1 mL。取0.3 mL靜脈血，采用ONETOUCHⅡ血糖儀檢測(cè)空腹血糖水平。將0.7 mL靜脈血以3 000 r/min離心10 min，獲取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)HbA1c水平，采用125I-胰島素放射免疫法檢測(cè)FINS水平，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)指數(shù)，HOMA-IR指數(shù)=空腹血糖(mmol/L)×FINS(μU/mL)/22.5。

1.4.3 心肌酶和炎癥因子水平：完成尾靜脈采血后麻醉小鼠，取腹主動(dòng)脈血1 mL，以3 000 r/min離心10 min后獲取血清，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清CK-MB、cTnI、CK、TNF-α、iNOS、IL-4及IL-10水平。

1.4.4 Western blot檢測(cè)小鼠心肌組織的iNOS和IL-10蛋白表達(dá)水平：完成腹主動(dòng)脈取血后處死小鼠，立即分離心肌組織。取一部分心肌組織用剪刀剪碎后，加入RIPA裂解液勻漿，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，切割目的蛋白凝膠后采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，將PVDF膜浸于5%脫脂牛奶中，室溫下封閉2 h，接著浸于一抗工作液中(iNOS、IL-10稀釋比為1 ∶500，GAPDH稀釋比為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，然后浸于稀釋比為1 ∶5 000的二抗工作液中，37 ℃孵育1 h，最后采用ECL發(fā)光顯影。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值和內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.5 HE染色法觀察心肌組織的病理學(xué)變化： 取部分心肌組織，經(jīng)4%甲醛溶液固定后，行石蠟包埋、切片，脫蠟后用梯度乙醇脫水，隨后依次行蘇木精染色、伊紅染色，最后用二甲苯透明10 min，適量中性樹(shù)膠封片，在400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠心肌組織的病理學(xué)變化。

1.4.6 TUNEL染色法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況：取剩余心肌組織，石蠟包埋并切片后，放入二甲苯中脫蠟，然后水化、PBS洗滌，加入TUNEL染色試劑，避光孵育45 min，加入DAPI染細(xì)胞核，置于400倍的光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核呈棕色)，細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組小鼠肥胖指數(shù)的比較 5組小鼠的肥胖指數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，與健康對(duì)照組相比，模型組、低劑量柿葉水提物組、中劑量柿葉水提物組小鼠的肥胖指數(shù)均升高(均P<0.05)；與模型組及低劑量柿葉水提物組比較，中、高劑量柿葉水提物組小鼠的肥胖指數(shù)均降低，且肥胖指數(shù)的變化呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組小鼠肥胖指數(shù)的比較(x±s)

2.2 5組小鼠空腹血糖水平、HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)的比較 5組小鼠的空腹血糖水平、HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，與健康對(duì)照組相比，模型組、低劑量柿葉水提物組、中劑量柿葉水提物組小鼠的空腹血糖水平、HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)均升高，高劑量柿葉水提物組小鼠HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)亦均升高(均P<0.05)；與模型組及低劑量柿葉水提物組相比，中、高劑量柿葉水提物組小鼠的空腹血糖水平、HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)均降低，且空腹血糖、HbA1c水平的變化呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組小鼠空腹血糖水平、HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)的比較(x±s)

2.3 5組小鼠血清TNF-α、iNOS、IL-4及IL-10水平的比較 5組小鼠的血清TNF-α、iNOS、IL-4及IL-10水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，與健康對(duì)照組相比，模型組及3個(gè)劑量柿葉水提物組小鼠的血清TNF-α、iNOS、IL-4及IL-10水平均升高(均P<0.05)；與模型組及低劑量柿葉水提物組相比，中、高劑量柿葉水提物組小鼠的血清TNF-α、iNOS水平均降低，血清IL-4及IL-10水平均升高，且上述指標(biāo)的變化呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 5組小鼠血清TNF-α、iNOS、IL-4及IL-10水平的比較(x±s，pg/mL)

2.4 5組小鼠心肌組織iNOS和IL-10蛋白表達(dá)水平的比較 5組小鼠心肌組織的iNOS和IL-10蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，與健康對(duì)照組相比，模型組及3個(gè)劑量柿葉水提物組小鼠心肌組織的iNOS和IL-10蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；與模型組及低劑量柿葉水提物組相比，中、高劑量柿葉水提物組小鼠心肌組織的iNOS蛋白表達(dá)水平均降低，IL-10蛋白表達(dá)水平均升高，且上述指標(biāo)的變化呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

圖1 5組小鼠心肌組織的iNOS和IL-10蛋白表達(dá)情況

表4 5組小鼠心肌組織iNOS和IL-10蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.5 5組小鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平的比較 5組小鼠的血清cTnI、CK、CK-MB水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，與健康對(duì)照組相比，模型組、低劑量柿葉水提物組、中劑量柿葉水提物組小鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平均升高，高劑量柿葉水提物組cTnI、CK水平亦均升高(均P<0.05)；與模型組及低劑量柿葉水提物組相比，中、高劑量柿葉水提物組小鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平均降低，且上述指標(biāo)的變化呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 5組小鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平的比較(x±s)

2.6 5組小鼠心肌組織的病理學(xué)變化 健康對(duì)照組小鼠心肌組織的肌外膜、心肌纖維均正常完整，且排列較為整齊；模型組小鼠心肌組織的肌紅蛋白溶解，心肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂、心肌纖維彎曲，細(xì)胞排列雜亂無(wú)章；低劑量柿葉水提物組小鼠的心肌組織病理變化情況與模型組相似；中、高劑量柿葉水提物組小鼠心肌組織中有少量肌纖維斷裂溶解彎曲，以及少量心肌細(xì)胞核固縮，但上述病理?yè)p傷較模型組及低劑量柿葉水提物組減輕。見(jiàn)圖2。

圖2 5組小鼠心肌組織的病理學(xué)變化(HE染色，×400)

2.7 5組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況的比較 5組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，與健康對(duì)照組相比，模型組及3個(gè)劑量柿葉水提物組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率均升高(均P<0.05)；與模型組及低劑量柿葉水提物組相比，中、高劑量柿葉水提物組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率均降低，且心肌細(xì)胞凋亡率的變化呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)圖3、表6。

圖3 5組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

表6 5組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率的比較(x±s，%)

3 討 論

研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可以上調(diào)內(nèi)臟脂肪組織中血管緊張素原基因的表達(dá)，并可以通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶信號(hào)通路加重胰島素抵抗，從而導(dǎo)致脂代謝和糖代謝紊亂[8]。張麗萍[9]的研究結(jié)果顯示，內(nèi)臟脂肪功能失常或胰島素抵抗與脂代謝紊亂、高血壓、高血糖和炎癥均密切相關(guān)。胰島素水平和胰島素抵抗是評(píng)估糖尿病病情的重要指標(biāo)[10]。胰島細(xì)胞受損會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，使機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性下降，最終導(dǎo)致組織器官的代謝異常[11]。除胰島素水平外，HbA1c也是診斷糖尿病的指標(biāo)之一，HbA1c是紅細(xì)胞中的血紅蛋白與血液中的葡萄糖經(jīng)過(guò)緩慢而不可逆的非酶促反應(yīng)結(jié)合而形成的產(chǎn)物，其水平升高表明胰島細(xì)胞受損[12]。本研究采用D12492i高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立糖尿病模型，結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，模型組小鼠肥胖指數(shù)、空腹血糖水平、HbA1c水平及HOMA-IR指數(shù)均升高(均P<0.05)，這提示高脂飼料喂養(yǎng)建立的糖尿病小鼠模型可以模擬臨床糖尿病患者的疾病特征。柿葉的生物學(xué)效用豐富，可用于咳嗽、冠心病、動(dòng)脈硬化等多種疾病的預(yù)防與治療，其提取物的效果更好。曹旭等[13]的研究表明，柿葉中的二氯甲烷萃取物可以有效調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的血糖和血脂水平。曹芬等[14]研究發(fā)現(xiàn)，柿葉提取物可以減輕糖尿病小鼠的胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量柿葉水提物組小鼠的空腹血糖水平、HbA1c水平、HOMA-IR指數(shù)及肥胖指數(shù)均低于模型組(均P<0.05)，這提示柿葉水提物可以有效調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的糖代謝和脂代謝，并改善糖尿病小鼠的肥胖癥狀。這可能是因?yàn)槭寥~水提物中含有黃酮類(lèi)化合物和酚性化合物，這兩類(lèi)化合物具有抗脂質(zhì)氧化、增強(qiáng)免疫的功能，可調(diào)節(jié)小鼠的血脂水平；黃酮類(lèi)化合物還可以阻斷腎上腺素受體對(duì)血管的收縮作用，并通過(guò)增加抗氧化酶的活性來(lái)減輕胰島細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，使機(jī)體胰島素水平趨于正常，達(dá)到調(diào)節(jié)糖代謝、降低血糖的作用[15-16]。

有研究顯示，糖尿病小鼠發(fā)生脂代謝紊亂后，其脂肪組織內(nèi)存在大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)脂肪儲(chǔ)存信號(hào)的過(guò)度反饋使機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)被激活[17]。目前研究較多的炎癥因子有TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎癥因子和IL-2、IL-12、IL-4、IL-10等抑炎癥因子[18-19]。此外，iNOS作為炎癥相關(guān)信號(hào)通路下游因子，在炎癥反應(yīng)中也具有重要作用。成芳梅等[20]的研究結(jié)果顯示，柿葉水提物可以有效降低小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TNF-α、iNOS、IL-4及IL-10水平均升高，心肌組織的iNOS和IL-10蛋白表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.05)，這提示在糖尿病小鼠中慢性炎癥反應(yīng)的激活可上調(diào)TNF-α等促炎癥因子表達(dá)，同時(shí)可刺激機(jī)體釋放一定的抑炎癥因子，但抑炎癥因子不足以降低整體炎癥反應(yīng)水平。與模型組相比，中、高劑量柿葉水提物組小鼠的血清TNF-α、iNOS水平降低，血清IL-4、IL-10水平升高，心肌組織的IL-10蛋白表達(dá)水平升高，而iNOS蛋白表達(dá)水平降低，且高劑量柿葉水提物組上述指標(biāo)的改善優(yōu)于中劑量柿葉水提物組(均P<0.05)。這提示柿葉水提物可以抑制糖尿病小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)，且40 g/kg柿葉水提物的干預(yù)效果更優(yōu)。

糖尿病可導(dǎo)致組織器官的代謝異常從而影響各組織器官的正常功能，心臟是糖尿病常見(jiàn)的受累器官之一[21]。糖尿病導(dǎo)致的心肌損傷可使心肌細(xì)胞肥大、纖維化及凋亡。黃永洪等[7]的研究表明，柿葉水提物可以有效減輕心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠心肌組織的肌紅蛋白溶解，心肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂、心肌纖維彎曲，細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，且血清cTnI、CK、CK-MB水平均高于健康對(duì)照組(均P<0.05)，這提示糖尿病小鼠存在心肌受損；而中、高劑量柿葉水提物組小鼠心肌組織病理?yè)p傷較模型組減輕，血清cTnI、CK、CK-MB水平和心肌細(xì)胞凋亡率均低于模型組，且高劑量柿葉水提物組上述指標(biāo)的改善優(yōu)于中劑量柿葉水提物組(均P<0.05)。這提示柿葉水提物可以改善糖尿病小鼠的心肌損傷，且40 g/kg柿葉水提物的干預(yù)效果更優(yōu)。這可能是因?yàn)槭寥~水提物中含有三菇類(lèi)化合物，后者可有效抑制氧化反應(yīng)從而保護(hù)心肌細(xì)胞，同時(shí)柿葉水提物中的黃酮類(lèi)化合物可以抑制炎癥反應(yīng)，這兩類(lèi)物質(zhì)的協(xié)同作用可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞功能。但本研究結(jié)果顯示，低劑量柿葉水提物組小鼠的各項(xiàng)觀察指標(biāo)與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，這提示柿葉水提物劑量<20 g/kg時(shí)作用效果并不明顯，其原因可能與有效成分含量偏少有關(guān)。

綜上所述，柿葉水提物可改善高脂誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的心肌損傷，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素抵抗、炎癥因子及免疫因子水平來(lái)發(fā)揮作用，且部分效果具有一定的劑量依賴(lài)性。