基于血清外異蛋白A水平構建的2型糖尿病患者合并糖尿病視網膜病變診斷模型▲

王 月 王銀玲 杜 姝 梁 娟 劉 璐 孔 雪 朱琳玲

(蘇州市第五人民醫院1 肝病科，2 感染科，江蘇省蘇州市 215000；3 蘇州大學附屬理想眼科醫院眼底病科，江蘇省蘇州市 215000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是最常見且患病率較高的糖尿病微血管并發癥之一，其主要病理改變是視網膜血管閉塞性循環障礙[1]。DR嚴重威脅糖尿病患者的生存質量，同時給社會帶來嚴重的經濟負擔。早期篩查和防治DR，對于改善糖尿病患者的遠期預后至關重要[2]。越來越多的研究顯示，肝臟不僅是人體能量代謝的主要臟器，其還可以通過生成多種肝臟因子對機體的代謝穩態進行調控[3]。外異蛋白A(ectodysplasin A,EDA)是新發現的肝臟因子，屬于腫瘤壞死因子超家族的Ⅱ型跨膜蛋白[4]。近年來，EDA被證實具有促進炎癥反應、加重機體胰島素抵抗等作用，與代謝綜合征及脂肪肝等代謝性疾病的發生密切相關[5]。本研究通過收集合并和未合并DR的2型糖尿病患者的臨床資料，檢測其血清EDA水平，探討2型糖尿病患者合并DR的影響因素，并建立診斷模型，旨在為診斷2型糖尿病患者合并DR提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年1月至2020年6月期間在蘇州大學附屬理想眼科醫院就診的2型糖尿病患者的電子病歷資料。納入標準：符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[2]中的2型糖尿病診斷標準。排除標準：(1)其他原因導致的高血糖；(2)合并2型糖尿病相關急性并發癥；(3)妊娠期或哺乳期女性；(4)合并嚴重肝腎功能異常、心腦血管疾病或惡性腫瘤等。參照《糖尿病視網膜病變防治專家共識》[1]中關于DR的診斷標準，根據眼底檢查結果將患者分為無糖尿病視網膜病變(non-diabetic retinopathy,NDR)組及DR組。同時采用基于年齡-性別的最近鄰匹配法進行傾向性評分匹配，匹配后兩組的年齡及性別的標準化偏差(卡鉗值設為0.200)分別為0.127及0.048。 最終NDR組納入107例患者，DR組納入83例患者。所有患者均簽署知情同意書。本研究獲得蘇州大學附屬理想眼科醫院醫學倫理委員會批準(批準號：SLER2018112)。

1.2 眼底檢查方法 患者進入暗室休息5 min，待視覺適應后，由技師應用免散瞳眼底數碼照相機(TOPCON公司，型號：TRC-NW300)，以黃斑為中心拍攝視網膜彩色圖像，每只眼睛拍攝一張照片。由無法獲得患者病情資料的眼科醫生進行閱片和診斷。

1.3 一般資料的收集 測量所有患者的身高、體重、血壓、臀圍和腰圍，并計算體質指數和腰臀比。記錄患者的糖尿病病程、服藥史(半年內服用影響機體糖脂代謝的藥物)、吸煙史(半年內是否吸過煙)、飲酒史(飲酒次數≥3次/周)等資料。通過調查患者每周的工作、生活、休閑等活動量，獲得每周體力活動量，單位為MET-h/w，其中MET(metabolic equivalent of task)為代謝當量，是表示相對能量代謝水平和運動強度的重要指標，通常以靜息代謝的能耗水平為基礎單位參考值。

1.4 血清學指標的檢測 抽取所有受試者的清晨空腹靜脈血10 mL，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，儲存于-80 ℃冰箱中待檢。采用全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號：BS-800)檢測空腹血糖、ALT、AST、γ-谷氨酰轉肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase,GGT)、三酰甘油、HDL-C及LDL-C水平。采用化學發光法，通過全自動流式熒光發光免疫分析儀(上海透景生命科技股份有限公司，型號：TESMI F4000)檢測空腹胰島素(fasting insulin,FINS)；采用高效液相離子交換色譜法，通過全自動糖化血紅蛋白分析儀(TOSOH公司，型號：G8)檢測HbA1c；計算穩態模型胰島素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)指數，HOMA-IR指數=空腹血糖(mmol/L)× FINS(μU/mL)/22.5。采用ELISA試劑盒(Cloud-Clone公司，編號SEB406Hu)檢測血清EDA水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學分析 采用SPSS 26.0和R 4.0.4軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗；計數資料以例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用二分類Logistic回歸模型進行單因素及多因素分析，根據多因素分析結果建立診斷模型；繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線和校正曲線分別評估診斷模型的區分度和校準度，當ROC曲線下面積>0.800時認為模型區分度良好，當校正曲線U指數<1.0、P值>0.05時表示模型校準度可接受。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料及血清學指標的比較 與NDR組相比，DR組患者的糖尿病病程更長，每周體力活動量更少，腰臀比、體質指數、HOMA-IR指數及空腹血糖、HbA1c、FINS、AST、EDA水平均更高，HDL-C水平更低(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料和血清學指標的比較

2.2 2型糖尿病患者合并DR影響因素的單因素及多因素分析 將糖尿病病程、每周體力活動量、腰臀比、體質指數、HOMA-IR指數及空腹血糖、HbA1c、 FINS、AST、EDA、HDL-C水平作為自變量，將2型糖尿病患者合并DR的情況作為因變量，納入二分類Logistic回歸模型(變量賦值見表2)進行單因素分析。結果顯示，糖尿病病程、每周體力活動量、腰臀比、體質指數、HOMA-IR指數及空腹血糖、FINS、HbA1c、EDA、HDL-C水平均與2型糖尿病患者合并DR有關(均P<0.05)，見表3。將以上單因素分析中具有統計學意義的變量納入二分類Logistic回歸模型進行多因素分析。結果顯示，糖尿病病程、腰臀比、空腹血糖及EDA水平均是2型糖尿病患者合并DR的影響因素(均P<0.05)，見表4。

表2 變量賦值情況

表3 單因素分析結果

表4 多因素分析結果

2.3 診斷模型的建立及驗證 根據多因素分析結果，建立2型糖尿病患者合并DR的診斷模型，其方程如下logitP=0.316×糖尿病病程+0.066×腰臀比+0.195×空腹血糖+0.011×EDA-13.752。ROC曲線分析結果顯示，該模型用于診斷2型糖尿病患者合并DR的曲線下面積為0.911(95%CI：0.872，0.951)，靈敏度為0.904，特異度0.785，準確度為0.837，陽性預測值、陰性預測值分別為0.765、0.913，見圖1A。其校正曲線的U指數為-0.011(P=0.914)，見圖1B。

圖1 ROC曲線和校正曲線

3 討 論

DR的發生和發展是一個較為復雜的病理生理過程，其具體的機制尚不明確[6]。目前的觀點認為糖尿病患者機體的能量代謝障礙，特別是胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂可誘發視網膜病變[7]。在病程10年以上的糖尿病患者中，DR的患病率高達80%，DR是全球中老年人視力喪失的首要病因[8]。近30年來，受人們飲食結構改變、人口老齡化等因素的影響，我國糖尿病患病率大幅增加。流行病學調查顯示，在我國糖尿病患者中，約有23%的患者合并視網膜病變，其中大部分患者為非增殖型DR[9]。由于DR具有早期隱蔽性、慢性進展性、不可逆性等特點，目前早期篩查工作仍然面臨諸多困難，應用合適的血清生物標志物或者無創性工具進行篩查是DR防治工作的重點[10]。

近年有研究顯示，肝臟在機體代謝中占有核心地位，其不僅是三大代謝完成的主要場所，還可通過生成一系列蛋白對機體代謝穩態產生重要影響[3，11-15]。這一系列蛋白被稱為肝臟因子，如胰島素樣生長因子1、成纖維細胞生長因子、血管生成素樣蛋白等，可以對機體糖脂能量代謝發揮各種復雜而精細的調節作用。肝臟因子的分泌異常往往會導致代謝性疾病的發生，而代謝性疾病的疾病進程也伴隨著肝臟因子的異常[16-18]。肝臟因子是否與DR發病相關，是否可以作為DR的生物標志物或者成為無創篩查工具的一部分，針對這些問題目前國內外尚未有報告，這也將是我們研究的重點。

既往研究證實，EDA可通過與EDA受體結合，胞內激活外異蛋白受體相關的死亡結構域，進而對細胞的代謝、免疫、炎癥、凋亡及應激等生理或病理過程進行調控[4，19-20]。Awazawa等[5]報告，通過篩選肥胖小鼠肝臟中表達失調的內含子miRNA發現，EDA基因在肥胖小鼠肝臟中的表達增加；隨后通過人體試驗再次驗證，肥胖人群肝臟中的EDA表達增加，而減肥后EDA表達下調，且EDA在肝臟中的表達與胰島素抵抗情況密切相關。Awazawa等[5]還發現，在肥胖的情況下，EDA在外周循環中含量上升，并可促進骨骼肌中c-Jun氨基末端激酶激活，同時抑制胰島素受體底物1的絲氨酸磷酸化，其認為EDA作為一個新發現的肝臟因子，在肥胖情況下可降低機體的胰島素敏感性。2019年，Yang等[21]發現，肝細胞脂肪變性可上調肝臟的EDA合成及分泌量，而EDA可通過打破脂質合成/氧化平衡，加重肝臟脂肪變性。隨后，Yang等[21]開展了一項病例對照研究，報告了人體血清EDA水平與非酒精性脂肪性肝病發生風險之間的關系，提示EDA可作為臨床脂肪肝篩查的潛在血清標記物。上述研究提示，EDA作為新發現的肝臟因子，可通過調節胰島素敏感性，參與肥胖和脂肪肝的病理生理變化。而肥胖、脂肪肝及糖尿病都是以機體胰島素抵抗為基礎的能量代謝性疾病，因此推測EDA可能參與糖尿病及其并發癥的發生、發展。故本研究基于血清EDA水平建立2型糖尿病合并DR的診斷模型。

本研究結果顯示，DR患者的血清EDA水平高于NDR組(P<0.05)；校正相關混雜因素后，糖尿病病程、腰臀比、空腹血糖及EDA水平均是2型糖尿病患者合并DR的影響因素(均P<0.05)。糖尿病病程長、空腹血糖水平升高的2型糖尿病患者合并DR的風險增加，這與既往研究[9]相似。機體長期處于高血糖狀態，可導致蛋白質發生非酶糖基化，進而引起基底膜增厚、微血管堵塞、削弱血紅蛋白攜氧能力、影響局部組織氧擴散，引起視網膜缺氧，從而推動DR發生和發展[22]。另外，腰臀比作為反映機體代謝綜合征的重要指標，與脂代謝密切相關，而脂代謝紊亂可通過脂質過氧化，引起血管壁損傷，促使脂質在微血管壁的沉積和滲漏，改變細胞膜脂質結構，甚至誘發微血栓形成，從而加重視網膜的滲出和水腫，破壞視網膜屏障功能[23]。EDA對DR發生與發展的影響，可能與其水平升高引起胰島素抵抗、脂代謝紊亂有關[19-21]。本研究通過上述4個重要變量，建立了2型糖尿病合并DR的診斷模型，驗證結果顯示該模型具有較好的區分度和校準度。該模型有助于在2型糖尿病患者中篩查出DR患者或DR高風險人群，特別是基層醫院，該模型有助于快速識別DR高風險人群，進而有針對性地進行分流，解決了基層醫院缺少專業眼科醫生的問題，節約了眼科專業設備和檢查的醫療資源，并可減少因誤診、漏診導致的DR相關性致盲、致殘。

綜上所述，血清EDA水平是2型糖尿病患者合并DR的影響因素之一。基于血清EDA水平及其他變量(包含空腹血糖、腰臀比、糖尿病病程)構建的模型，對2型糖尿病合并DR具有較好的診斷效能，可為糖尿病患者的DR篩查提供潛在的無創性工具。本研究的樣本是基于我院電子病歷庫獲得的真實世界數據，具有較高的參考價值。但仍需多中心的外部驗證進一步探討該診斷模型在DR診斷中的作用。