矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和生長激素釋放肽水平及其臨床意義▲

陸 燕 覃小升 韋新艷

(來賓市興賓區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣西來賓市 546100)

矮身材為兒科內(nèi)分泌門診最常見的疾病之一，亦是近年來臨床研究的一大熱點。其病因機(jī)制復(fù)雜多樣，不僅可引起兒童軀體異常，還可導(dǎo)致其自信心、自尊心、認(rèn)知發(fā)育、社交能力等方面出現(xiàn)一定程度的問題，影響兒童的身心健康[1]。因此，早期全面、準(zhǔn)確地對矮身材進(jìn)行診斷，有助于及時糾正影響兒童生長的負(fù)面因素，盡早預(yù)防性用藥，使兒童盡可能達(dá)到理想身高[2]。生長激素釋放肽(growth hormone-releasing peptide,Ghrelin)是作用于全身各系統(tǒng)并調(diào)控腺垂體分泌生長激素的內(nèi)源性配體，其不僅能夠調(diào)控生長激素的分泌，亦能夠維持能量平衡、刺激食欲、促進(jìn)胃酸分泌和胃蠕動，對生長發(fā)育有重要作用[3]。有研究表明，miRNA參與人體生長發(fā)育過程[4]，其中miR-125b是miRNA家族中相當(dāng)活躍的成員，目前已證實其在代謝、生長發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞凋亡與增殖等方面均發(fā)揮著重要作用[5-6]。然而，miR-125b、Ghrelin水平對矮身材早期診斷價值的研究仍較少。因而，本課題組分析了矮身材兒童的血清miR-125b和Ghrelin水平，并探討兩者的臨床意義，旨在為該病的臨床診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2017年8月至2020年12月收治的103例矮身材兒童作為研究組，其中男童60例、女童43例，年齡為3～7(4.57±1.11)歲，入組時身高0.78～1.10(0.92±0.09)m。另選取同期在我院體檢的100例健康兒童作為對照組，其中男童56例、女童44例，年齡為3～8(4.62±1.14)歲。兩組兒童的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。所有監(jiān)護(hù)人均已了解本研究的大致流程及目的、內(nèi)容、獲益等，并簽署知情同意書。

1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 矮身材的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《矮身材兒童診治指南》[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，即在相似生活環(huán)境下，同種族、同性別和同年齡的兒童身高低于健康兒童第3百分位數(shù)以下或者2個標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.2 研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)未伴有甲狀腺功能衰退；(2)未合并遺傳代謝病或基因異常，如特納綜合征等；(3)出生時體重正常；(4)近期無重癥感染或急性創(chuàng)傷病史；(5)經(jīng)血鈣、血磷等檢查證實無活動期佝僂病。

1.2.3 研究對象的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)情志、飲食生活習(xí)慣不良者；(2)身材比例不協(xié)調(diào)，疑似骨骼發(fā)育異常者；(3)存在代謝性疾病及其他慢性疾病引起的生長遲緩者；(4)入組前3個月內(nèi)曾經(jīng)接受過糖皮質(zhì)激素、生長激素治療者；(5)存在重要臟器疾病者。

1.3 一般資料的收集 收集并記錄患兒入組時的年齡、性別、身高、體重，以及患兒父母的身高。計算體質(zhì)指數(shù)和靶身高。體質(zhì)指數(shù)=體重(kg)/身高2(m2)。靶身高計算公式：男童身高=[父親身高(cm)+母親身高(cm)+13 cm]÷2，女童身高=[父親身高(cm)+母親身高(cm)-13 cm]÷2。

1.4 治療方法 所有矮身材患兒均接受生長激素治療[8]，即給予重組人生長激素注射液(長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：30 IU/10 mg；批號：20170929；國藥準(zhǔn)字S20050025)0.15～0.20 IU/(kg·d)，每晚睡前半小時皮下注射，均連續(xù)治療6個月。

1.5 骨齡測定 入組時拍攝左手正位+腕部X線片。根據(jù)X線片圖像，運用《中國青少年兒童手腕骨成熟度及評價方法》[9]評估患兒的骨齡，并計算年齡與骨齡的差值，表示為年齡-骨齡。

1.6 實驗室指標(biāo)的檢測

1.6.1 標(biāo)本采集：研究組患兒于入院24 h內(nèi)、治療3個月和6個月后，對照組兒童于體檢當(dāng)日，抽取清晨空腹靜脈血10 mL，分置兩管，于室溫保存。

1.6.2 實時熒光定量PCR檢測血清miR-125b表達(dá)水平：取其中一管血液標(biāo)本，采用TRIzolTM試劑[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，貨號：15596026)]提取標(biāo)本血清RNA，微量核酸定量Qubit Flex 熒光計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]測定A260、A280值，并計算總RNA濃度，所提取的總RNA質(zhì)量(A260/A280比值在1.8～2.2之間)和濃度(20 ng/μL以上)均符合PCR反應(yīng)要求，隨后于-80 ℃凍存，所有樣本均于1個月內(nèi)檢測。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號：LM-266)說明書，取2 μL RNA溶液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板。采用Primer軟件設(shè)計引物，miR-125b上游引物序列為TCCCACGTGACGACGTCTAT，下游引物序列為TCGAGTCATGTTCACCGGACTG；U6(內(nèi)參)上游引物序列為CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列為AACGCTTCACGAATTTGCGT。PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括Taq DNA聚合酶0.2 μL、Mg2+2.0 μL、模板DNA 0.2 μg、dNTPs 2 μL、引物0.5 μL，加雙蒸水或三蒸水至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。在60 ℃時采集熒光信號，記錄Ct值，以2-ΔΔCt法計算miR-125b的相對表達(dá)水平。為避免因各樣本總RNA濃度的不同或是其他不可控因素導(dǎo)致的誤差，同一條件檢測3次，取其平均值。

1.6.3 ELISA檢測血清Ghrelin水平：取另外一管血液標(biāo)本，采用離心機(jī)低速離心(離心速度為3 500 r/mim，離心半徑為8 cm，溫度為4 ℃)20 min后獲取血清，使用ELISA試劑盒(上海語純生物科技有限公司，批號：20170712)檢測血清Ghrelin水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，重復(fù)測量計量資料的比較采用單因素重復(fù)測量方差分析；計數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。使用Pearson檢驗進(jìn)行相關(guān)分析性，使用Logistic回歸模型分析血清學(xué)指標(biāo)與兒童矮身材的相關(guān)性。以P<0.05為差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平的比較 研究組治療前的血清miR-125b表達(dá)水平及Ghrelin水平均高于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平比較(x±s)

2.2 血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平與兒童矮身材的相關(guān)性 以是否出現(xiàn)矮身材作為因變量，選取現(xiàn)研究認(rèn)為可能與兒童矮身材相關(guān)的因素(靶身高、父親身高、母親身高、年齡-骨齡)、血清miR-125b表達(dá)水平、血清Ghrelin水平作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。變量賦值見表2。在校正相關(guān)因素后，血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均與兒童矮身材相關(guān)(均P<0.05)，見表3。

表2 變量賦值表

表3 Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平與治療效果的關(guān)系 矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均隨著治療時間的延長而降低(均P<0.05)，見表4。

表4 治療前后矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平的變化(x±s)

3 討 論

目前疾病監(jiān)測手段不斷更新，更多的生物標(biāo)志物應(yīng)運而生。作為結(jié)構(gòu)和功能較為明確的內(nèi)源性配體，Ghrelin在人體生長發(fā)育中的作用得到諸多研究者的關(guān)注[10-11]。國外學(xué)者M(jìn)aldonado-Ruiz等[12]通過一項動物實驗發(fā)現(xiàn)，孕期母體營養(yǎng)過剩可出現(xiàn)Ghrelin高表達(dá)，而通過藥物治療抑制Ghrelin表達(dá)能夠有效改善大鼠后代肥胖、貪食等表現(xiàn)及機(jī)體炎癥水平。Yokota-Nakagi等[13]發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)Ghrelin及其受體的表達(dá)來抑制Ghrelin的促食欲作用，可緩解去卵巢肥胖大鼠的能量攝入紊亂和體重超標(biāo)等情況。此外，有學(xué)者通過觀察不同病因矮小癥兒童在生長激素治療前后的Ghrelin水平發(fā)現(xiàn)，矮小癥患兒可能存在Ghrelin抵抗，血清Ghrelin水平有助于評估矮小癥患兒治療期間的生長情況[14]。近年來國內(nèi)外的最新臨床試驗研究[15-16]同樣也支持這一結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，矮身材兒童治療前的血清Ghrelin水平高于健康兒童，且Logistic回歸分析結(jié)果提示血清Ghrelin水平升高與兒童矮身材相關(guān)(P<0.05)，與解欣等[17]的研究相似。Ghrelin不僅可通過不同的方式調(diào)控生長激素-胰島素軸，還能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和功能，誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞的增殖及分化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)骨骼代謝與機(jī)體能量代謝，從而影響骨骼的生長狀態(tài)，因此推測抑制Ghrelin活化可調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡、調(diào)控骨發(fā)育等[18]。由此可見，矮身材兒童體內(nèi)Ghrelin呈反饋性增高，從而在促進(jìn)生長發(fā)育中起重要作用。

人的生長和最終身高亦受到遺傳因素的影響，而表觀遺傳調(diào)控機(jī)制涉及DNA甲基化、組蛋白修飾及miRNA[19]。miRNA是一種高度保守的、長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其主要通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，以激活下游的靶因子，從而調(diào)控細(xì)胞的病理過程[20]。miRNA參與多個生命過程，其中miR-125b在內(nèi)分泌疾病的發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用已逐漸得到關(guān)注。唐家彥等[21]發(fā)現(xiàn)，中樞性性早熟女童的血清miR-125b表達(dá)水平升高，是下丘腦-垂體-性腺軸過早激活的可能作用機(jī)制。此外，郭東光等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-125b與細(xì)胞的生長、分化和發(fā)育功能相關(guān)，而Ghrelin可通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和分化；這一發(fā)現(xiàn)亦證實了細(xì)胞增殖分化過程中Ghrelin與miR-125b存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，后者可能是調(diào)節(jié)生長發(fā)育的重要潛在靶基因。本研究結(jié)果顯示，矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平高于健康兒童，且Logistic回歸分析結(jié)果提示血清miR-125b表達(dá)水平升高與兒童矮身材相關(guān)(P<0.05)，這符合矮身材的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制，表明miR-125b參與矮身材兒童的生長發(fā)育。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著治療時間的延長，血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均降低(P<0.05)，即隨著治療藥物起效，矮身材兒童的生長發(fā)育趨于正常后，其體內(nèi)的miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平也隨之下調(diào)。這也間接表明，監(jiān)測血清miR-125b和Ghrelin水平有助于判斷病情的發(fā)展和預(yù)后，從而及時調(diào)整矮身材兒童的治療方案。

綜上所述，矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均升高，兩者在促進(jìn)矮身材兒童生長發(fā)育過程中起著重要作用，且有助于評估矮身材兒童的治療效果。但本研究樣本量相對較小，這可能對結(jié)果可信度造成一定影響。因此今后仍需開展大樣本、多中心的臨床研究對本研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步論證。