斯鈣素2在喉癌組織中的表達(dá)水平及其對患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的預(yù)測價(jià)值▲

高 暉 王海鵬 李冬雷

(陜西省人民醫(yī)院1 放療科，2 腫瘤內(nèi)科，陜西省西安市，710068；3 保定市第二中心醫(yī)院腫瘤科，河北省涿州市 072750)

喉癌是常見的上呼吸道惡性腫瘤，其常見的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌[1]。喉癌患者的5年生存率為60%左右，雖然目前喉癌的診治水平已取得較大提高，但其生存率并無明顯改善[2]。腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等是喉癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵原因[3]，尋找喉癌進(jìn)展過程中的分子標(biāo)志物對于改善患者的預(yù)后有重要意義。

斯鈣素2(stanniocalcin 2,STC2)屬于糖蛋白激素，在消化系統(tǒng)腫瘤、頭頸部腫瘤、乳腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)。STC2參與鈣磷代謝，還能加快腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。STC2通過多條信號傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移、化療耐藥等，其可能是腫瘤分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子之一[5]。故深入探討STC2在惡性腫瘤中的作用機(jī)制，可以為惡性腫瘤的臨床診治提供新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前尚無STC2在喉癌組織中的表達(dá)水平及其對患者術(shù)后輔助放療預(yù)后影響的研究。本研究探討STC2在喉癌組織中的表達(dá)水平，以及其對患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，以期為臨床上評估喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2017年12月在陜西省人民醫(yī)院及保定市第二中心醫(yī)院進(jìn)行術(shù)后輔助放療的90例喉癌患者作為研究對象。其中，男性85例、女性5例，年齡42～75(59.14±6.03)歲，鱗癌84例、腺癌6例，腫瘤位于聲門區(qū)33例、聲門上區(qū)55例、聲門下區(qū)2例，臨床分期為Ⅲ期31例、Ⅳa期 45例、Ⅳb期14例，低分化28例、中分化18例、高分化44例。在不影響喉腔重建的情況下，取同一患者喉腔黏膜處的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>10 mm)作為對照(n=90)。本研究經(jīng)陜西省人民醫(yī)院及保定市第二中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究對象的篩選標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟對喉癌的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]，患者處于T3期或T4期；(2)術(shù)前未進(jìn)行放療和化療，術(shù)后均進(jìn)行輔助放療(手術(shù)術(shù)式為全喉切除術(shù)；采用瑞典醫(yī)科達(dá)Synergy直線加速器精準(zhǔn)放療系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)分割調(diào)強(qiáng)放療，總劑量為60～66 Gy，分6周完成)；(3)所取組織術(shù)后病理證實(shí)為喉癌或癌旁正常組織；(4)無其他重要臟器疾病；(5)患者或其直系親屬對本研究知情同意并簽署知情同意書；(6)患者病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴重要器官損傷；(2)伴其他惡性腫瘤；(3)伴呼吸、循環(huán)或血液系統(tǒng)疾病；(4)精神障礙，無法正常交流；(5)隨訪信息不完整。

1.3 STC2表達(dá)情況的檢測 取喉癌組織或癌旁正常組織，用福爾馬林固定，進(jìn)行乙醇脫水，石蠟包埋切片，切片厚度為3 μm；進(jìn)行脫蠟、脫水常規(guī)處理，加入25 μL 3%過氧化氫室溫下孵育5～10 min，用去離子水沖洗3次，3～5 min/次。采用堿性磷酸酶封閉液(湖州英創(chuàng)生物科技有限公司，批號：20150801)封閉，室溫下孵育5 min，加入80 μL鼠抗人STC2單克隆抗體(無錫百邁格生物科技有限公司，批號：20150613，封閉液與抗體的比例為1 ∶10)，37 ℃下孵育2 h，用PBS洗滌3次，3～5 min/次，然后加入0.1 mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗(北京百奧萊博科技有限公司，批號：20150722，稀釋比為1 ∶100)，37 ℃下孵育30 min，用PBS重復(fù)洗滌3次，3～5 min/次，最后加入四氮唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽堿性磷酸酶顯色試劑(北京百奧萊博科技有限公司，批號：20150112)顯色5 min，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，置于OLIPICS電子顯微鏡(上海精密儀器有限公司)下觀察。STC2陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)中有棕黃色顆粒，通過染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行綜合評分。染色強(qiáng)度無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分；陽性細(xì)胞比例≤10%計(jì)0分，11%～30%計(jì)1分，31%～70%計(jì)2分，≥71%計(jì)3分；綜合評分為染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞比例評分的乘積，將綜合評分≤2分定義為陰性表達(dá)，綜合評分≥3分定義為陽性表達(dá)。根據(jù)喉癌組織中STC2的表達(dá)情況，將90例患者分為STC2陽性表達(dá)組(n=54)和STC2陰性表達(dá)組(n=36)。

1.4 預(yù)后評價(jià) 以電話等方式隨訪3年，記錄患者的無病生存期(disease-free survival,DFS)。DFS定義為術(shù)后輔助放療開始第1天至第1次局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間。局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的評價(jià)方法：對下咽部、喉部進(jìn)行電子喉鏡檢查，對頸部進(jìn)行觸診，必要時(shí)進(jìn)行頸部CT或MRI、血常規(guī)、血生化、胸片、食道吞鋇、腹部B超等檢查。腫瘤直接蔓延突破喉外，喉外毗鄰器官受侵，如侵犯舌根、下咽、頸段食管、皮膚及甲狀腺為局部復(fù)發(fā)；出現(xiàn)咳嗽、胸痛、肝區(qū)疼痛、黃疸及骨痛等相應(yīng)癥狀為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線的差異；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析喉癌患者喉癌組織中STC2的表達(dá)情況對術(shù)后輔助放療預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 隨訪情況 所有患者自術(shù)后輔助放療第1天開始隨訪，隨訪截止日期為 2020年12月30日。所有患者隨訪1～3年，中位隨訪時(shí)間為2.12年；失訪5例，其中STC2陽性表達(dá)組失訪2例，STC2陰性表達(dá)組失訪3例，失訪原因?yàn)槁?lián)系方式更換等。完成隨訪的85例患者中，有52例術(shù)后3年內(nèi)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，60例在術(shù)后3年內(nèi)局部復(fù)發(fā)，15例死亡(均死于喉癌)。

2.2 喉癌組織和癌旁正常組織的STC2陽性表達(dá)率比較 喉癌組織中STC2陽性表達(dá)率為60.00%(54/90)，高于癌旁正常組織的44.44%(40/90)(χ2=4.364，P=0.037)。

2.3 不同特征患者喉癌組織中STC2陽性表達(dá)率的比較 不同臨床分期、分化程度、術(shù)后3年內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后3年內(nèi)局部復(fù)發(fā)情況的患者之間喉癌組織中STC2陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 不同特征患者喉癌組織中STC2陽性表達(dá)率的比較[n(%)]

2.4 STC2陽性表達(dá)組與STC2陰性表達(dá)組患者的DFS比較 STC2陽性表達(dá)組喉癌患者中位DFS為24.72個(gè)月，STC2陰性表達(dá)組喉癌患者中位DFS為30.16個(gè)月。兩組患者的中位DFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.953，P<0.001)。見圖1。

圖1 不同STC2表達(dá)情況喉癌患者的生存曲線

2.5 STC2陽性表達(dá)預(yù)測喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的ROC曲線分析 STC2陽性表達(dá)預(yù)測喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后(術(shù)后3年內(nèi)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)的ROC曲線下面積為0.915(95%CI：0.855，0.975；P=0.001)，敏感度和特異度分別為88.30%、80.00%，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為88.30%、80.00%。見圖2。

圖2 STC2陽性表達(dá)預(yù)測喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

喉癌是一種十分高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，在頭頸部惡性腫瘤中的占比為14%，在全身性惡性腫瘤中的占比約為2%，其預(yù)后與治療方式、手術(shù)切緣和術(shù)后放化療等因素存在一定的關(guān)系[7]。當(dāng)前，放化療、手術(shù)治療和分子靶向治療是喉癌的主要治療手段，其中以放療和手術(shù)治療最為常見[8]。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，從分子水平研究喉癌的疾病過程是當(dāng)前臨床研究十分重要的課題。喉癌的進(jìn)展會導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)流行病學(xué)研究顯示，喉癌的發(fā)生率為233/10萬至456/10萬，在長期隨訪的過程中喉癌患者的整體預(yù)后并不理想，治療后病情改善不明顯[9]。諸多因素可能對喉癌的進(jìn)展產(chǎn)生影響，尤其是細(xì)胞分子水平的變化，可對癌細(xì)胞的形態(tài)、功能及相關(guān)特性產(chǎn)生不同程度的影響，從而促進(jìn)疾病進(jìn)展[10]。

STC2是一種與鈣磷代謝有關(guān)的因子，其表達(dá)水平的變化可引起機(jī)體腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征發(fā)生改變，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能產(chǎn)生影響，STC2能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在的鈣感受器基質(zhì)相互作用分子1相互作用，對鈣池所調(diào)控的鈣離子通道進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)，損傷腫瘤細(xì)胞中的線粒體，使其細(xì)胞周期發(fā)生異常，顯著提高G1/S期細(xì)胞比例[11]。STC2高表達(dá)可抑制下游膜結(jié)合型監(jiān)護(hù)蛋白鈣連蛋白的表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，使得癌細(xì)胞對臨近正常組織的浸潤能力增強(qiáng)[12]。陳永祿等[13]發(fā)現(xiàn)，STC2表達(dá)水平與喉癌患者的臨床病理特征緊密相關(guān)，臨床分期越高，STC2的表達(dá)水平越高，并且在分化程度較低或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，STC2表達(dá)水平更高，這與STC2可以上調(diào)喉癌患者淋巴結(jié)黏附分子表達(dá)，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，繼而加速疾病進(jìn)展有關(guān)。由此可見，STC2可能對喉癌的發(fā)生和發(fā)展過程產(chǎn)生重要影響，探究STC2在喉癌疾病進(jìn)展過程中的作用機(jī)制可為該病的診治及預(yù)后評估提供新的參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，喉癌組織中STC2陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織(P<0.05)，說明STC2的高表達(dá)對喉癌的發(fā)生有重要影響。由于腫瘤細(xì)胞生長較快，導(dǎo)致腫瘤組織血供不足，組織缺氧，此時(shí)腫瘤細(xì)胞發(fā)生一系列基因和代謝改變，代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝，導(dǎo)致乳酸和丙酮酸大量堆積、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)上調(diào)，STC2為蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶/活化轉(zhuǎn)錄因子4/C/EBP同源蛋白信號通路和HIF-1下游靶基因，HIF-1結(jié)合STC2的啟動子區(qū)域，導(dǎo)致細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路被激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，提升其抗凋亡的能力[14]。本研究結(jié)果還顯示，不同臨床分期、分化程度、術(shù)后3年內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)情況的患者之間喉癌組織中STC2陽性表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，STC2陽性表達(dá)的喉癌患者中位DFS短于STC2陰性表達(dá)的喉癌患者(P<0.05)，提示STC2蛋白的表達(dá)與喉癌患者的病情程度及術(shù)后輔助放療的預(yù)后有關(guān)。分析原因?yàn)椋荷掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)化與癌細(xì)胞的多種惡性行為緊密相關(guān)，尤其是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通常會失去上皮細(xì)胞特性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞特性；具有間質(zhì)細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞侵襲性更強(qiáng)，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其通常具有高分化干細(xì)胞的特性，生存能力極強(qiáng)。STC2主要參與機(jī)體的鈣磷代謝，而鈣離子是信號傳導(dǎo)通路中十分關(guān)鍵的第二信使，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)為其重要的下游靶標(biāo)，PKC通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白claudin-1參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制；claudin-1屬于內(nèi)膜蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞極性，對細(xì)胞間的緊密連接具有十分關(guān)鍵的作用；STC2通過PKC/claudin-1信號通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，繼而對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起到調(diào)控作用[15]。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，STC2陽性表達(dá)預(yù)測喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的敏感度和特異度分別為88.30%、80.00%，曲線下面積為0.915，提示STC2預(yù)測喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的準(zhǔn)確性較高，因此STC2或可作為判斷喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，STC2在喉癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，且與喉癌患者術(shù)后輔助放療的預(yù)后有關(guān)，或可作為喉癌患者術(shù)后輔助放療預(yù)后的預(yù)測因子。但本研究存在樣本量較小的不足，所得結(jié)果有待進(jìn)一步研究以驗(yàn)證。