半乳糖凝集素3對肺癌細胞生物學行為和免疫相關因子的影響及可能機制▲

陳耀華 豆亞偉

(陜西省人民醫院胸外科，陜西省西安市 710068)

肺癌是病死率極高的惡性腫瘤，占所有癌癥類型的26%～29%，其中肺腺癌是肺癌最常見的類型[1]。研究顯示，免疫抑制在肺癌的發生和發展過程中起著重要的作用，腫瘤細胞可以通過分泌白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等因子促進腫瘤轉移并抑制免疫細胞活性[2-3]。Notch通路可介導肺癌細胞的免疫抑制，與肺癌的發生和發展密切相關[4]。半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)具有交聯和聚集整聯蛋白的能力，其不但可以調控細胞的增殖和凋亡，還可通過與整合素共同作用來介導細胞的遷移[5]。臨床研究顯示，Gal-3的高表達與肺癌患者復發風險增加有關[6]。還有研究顯示，口服活性Gal-3拮抗劑可以抑制肺癌的進展[7]。這些研究均提示Gal-3參與了肺癌的發生和發展，且與預后密切相關，但是其對肺癌進展的調控機制仍不清楚。故本文探討Gal-3對肺癌細胞生物學行為及免疫相關因子的影響，并基于Notch信號通路分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人肺癌細胞A549(美國ATCC?CCL-185)，胎牛血清和鏈-青霉素(Invitrogen公司，批號：20200612、20200709)，DMEM(Thermo Fisher Scientific公司，批號：20210116007)。Gal-3過表達質粒及陰性對照質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司，批號：200315001、200402003)，LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司，批號：20021809)，Notch信號通路抑制劑LY450139(Selleck公司，批號：191209004)，Gal-3一抗、Notch受體1(Notch receptor 1,NOTCH1)一抗、Gal-3和NOTCH1相應二抗(Abcam公司，批號：191106003、200123009、200322008、191226011)，硝酸纖維素膜(Millipore公司，批號：200112002)，ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號：19110302)，Annexin Ⅴ-FITC試劑盒和碘化丙啶試劑盒(YEASEN公司，批號：190912003、200423021)。TRIzol試劑和RNAspin Mini試劑盒(QIAGEN GmbH公司，批號：200413、200510)，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司，批號：200318001)。流式細胞儀(BD公司，型號：BD-FACSAriaTMFusion)，基質膠和Transwell裝置(Corning公司，批號：20200112、20200203)，光學顯微鏡(Olympus公司，型號：BX53)。

1.2 細胞分組和轉染 將A549細胞接種于含有10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的完全DMEM，置于37 ℃、95%濕度、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期A549細胞，以5×105個/孔的密度接種在96孔板中，當細胞融合度達到60%后，將A549細胞分為4組，即對照組(轉染陰性對照質粒)、Gal-3組(轉染Gal-3過表達質粒)、LY450139組(給予2 μL終濃度為20 nmol/L的Notch信號通路抑制劑LY450139處理)、Gal-3+LY450139組(轉染Gal-3過表達質粒，并給予2 μL終濃度為20 nmol/L的LY450139處理)。轉染操作過程均嚴格根據LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。

1.3 觀察指標的檢測方法

1.3.1 Western blot檢測Gal-3和NOTCH1蛋白表達水平：取轉染72 h后的各組細胞，裂解后于4 ℃下12 000 r/min離心5min，收集總蛋白。取40 μg蛋白，通過10% SDS-PAGE分離等量蛋白，然后將其轉移到硝酸纖維素膜上。加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，加入5 μL Gal-3一抗、5 μL NOTCH1一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育8 h，TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL相應二抗(稀釋比均為1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。利用ECL顯色試劑盒對條帶進行顯影。以GAPDH(稀釋比為1 ∶10 000)作為內參，采用ImageJ軟件分析Gal-3和NOTCH1蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力：取轉染72 h后的各組細胞，以5×105個/孔的密度接種到96孔板中，置于37 ℃、95%濕度、5% CO2培養箱，分別孵育24 h、48 h后加入10 μL CCK-8溶液，繼續孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度值。實驗重復3次。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率：將轉染72 h后的各組細胞用1×PBS洗滌并懸浮在100 μL結合緩沖液中。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶，室溫下避光孵育10～15 min，加入400 μL結合緩沖液，在1 h內利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力：將基質膠(稀釋比為1 ∶8)加入Transwell小室的上室并在 37 ℃下孵育30 min。將600 μL完全DMEM加入Transwell小室的下室。取轉染72 h后的各組細胞，于無血清培養基中37 ℃下培養24 h進行饑餓處理。使用胰酶消化后，將100 μL 細胞溶液(5×105個/mL)接種于水合的 Transwell 小室上室中，置于37 ℃、95%濕度、5% CO2培養箱中培養24 h后，洗去未侵入的細胞。用95%乙醇固定侵入下室的細胞，用0.1%結晶紫在室溫下染色20 min。置于顯微鏡下觀察，隨機選取5個高倍視野(×400)進行細胞計數，取平均值。實驗重復3次。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測IL-6和TGF-β1的mRNA表達水平：取轉染72 h后的各組細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用RNAspin Mini試劑盒進行反轉錄，使用 SYBR Premix Ex TaqTM進行實時熒光定量PCR反應。IL-6上游引物序列為5′-TCAATGAGGAGACTTGCCTG-3′，下游引物序列為5′-GATGAGTTGTCATGTCCTGC-3′；TGF-β1上游引物序列為5′-CACCCGCGTGCTAATGG-3′，下游引物序列為5′-ATGCTGTGTGTACTCTGCTTGAACT-3′；內參GAPDH上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，上游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。反應體系(共50 μL)包括SYBR Green染料10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、dNTP 0.5 μL、Taq酶1 μL、模板DNA 5 μL、ddH2O 32.5 μL。反應條件為95 ℃ 2 min預加熱； 95 ℃ 2 min，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s， 共40個循環。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法計算IL-6和TGF-β1的mRNA相對表達水平。實驗重復3次。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組A549細胞Gal-3和NOTCH1蛋白表達水平的比較 4組A549細胞Gal-3和NOTCH1蛋白表達水平的比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。其中，Gal-3組的Gal-3和NOTCH1蛋白表達水平高于對照組；LY450139組的Gal-3蛋白表達水平低于Gal-3組，NOTCH1蛋白表達水平低于對照組和Gal-3組；Gal-3+LY450139組的Gal-3蛋白表達水平高于對照組和LY450139組，NOTCH1蛋白表達水平低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組細胞Gal-3和NOTCH1蛋白表達情況

表1 4組A549細胞Gal-3和NOTCH1蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.2 4組A549細胞增殖活力的比較 孵育24 h、48 h后，4組A549細胞的增殖活力比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。其中孵育24 h、48 h后，Gal-3組的增殖活力均高于對照組，LY450139組的增殖活力低于對照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的增殖活力低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)。見表2。

表2 4組A549細胞增殖活力的比較(x±s，光密度值)

2.3 4組A549細胞凋亡率的比較 4組A549細胞的凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，Gal-3組的凋亡率低于對照組，LY450139組的凋亡率高于對照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的凋亡率高于Gal-3組，但低于LY450139組(均P<0.05)。見圖2、表3。

對照組 Gal-3組 LY450139組 Gal-3+LY450139組

表3 4組A549細胞凋亡率的比較(x±s，%)

2.4 4組A540細胞侵襲能力的比較 4組A549細胞的侵襲能力比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，Gal-3組的侵襲能力高于對照組，LY450139組的侵襲能力低于對照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的侵襲能力低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)。見圖3、表4。

對照組 Gal-3組 LY450139組 Gal-3+LY450139組

表4 4組A549細胞侵襲能力的比較(x±s，個)

2.5 4組A549細胞免疫相關因子表達水平的比較 4組A549細胞的IL-6和TGF-β1 mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。其中，Gal-3組的IL-6和TGF-β1 mRNA表達水平高于對照組，LY450139組的IL-6和TGF-β1 mRNA表達水平低于對照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的IL-6和TGF-β1 mRNA水平低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)。見表5。

表5 4組A549細胞免疫相關因子mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，全球每年新發肺癌患者約210萬例，死于肺癌的患者約176萬例，在所有惡性腫瘤中其發病率居于前列[8]。雖然近年來有新的治療方法應用于臨床，但肺癌患者的預后仍不盡如人意，其5年總體生存率僅為15%左右[9]。因此分析肺癌的發生和發展機制對于臨床診斷和治療肺癌具有重要意義。

Gal-3是一種由LGALS3基因編碼的多功能蛋白，屬于β-半乳糖苷結合蛋白家族成員。作為一種胞質蛋白，Gal-3能輕易穿過細胞質膜進入細胞核和線粒體，從而調節多種生物過程[10]。大量研究表明，Gal-3可以調控血管生成、免疫抑制和細胞運動等過程，在腫瘤進展過程中發揮重要作用[11-12]。還有研究顯示，Gal-3在結直腸癌[13]、前列腺癌[14]、胰腺癌[15]等腫瘤中發揮介導免疫抑制和促進癌癥進展的作用。臨床研究顯示，Gal-3表達水平與肺癌的轉移有關[16]。體外研究顯示，Gal-3抑制劑可以增強程序性死亡受體配體1阻斷劑治療肺癌的效果[17]。但關于Gal-3在肺癌中的作用機制研究仍較少。

為分析Gal-3對肺癌細胞生物學行為的影響，本研究構建了過表達Gal-3的肺癌細胞模型，結果顯示，Gal-3組細胞的增殖活力和侵襲能力高于對照組，而凋亡率低于對照組(P<0.05)，說明過表達Gal-3會促進肺癌細胞的增殖和侵襲，并抑制其凋亡，提示Gal-3具有促進肺癌進展的作用。IL-6可促進肺癌細胞的轉移和侵襲[18]。TGF-β1不但會促進肺癌細胞的上皮-間充質轉化[19]，還會抑制淋巴細胞分化，降低免疫細胞活性，從而增強腫瘤細胞的免疫抑制，促進腫瘤進展[20]。本研究中，Gal-3組細胞的IL-6和TGF-β1 mRNA表達水平均高于對照組(均P<0.05)，提示Gal-3可抑制免疫相關因子IL-6和TGF-β1的表達，增強腫瘤細胞的免疫抑制，從而促進腫瘤的發展。

已有研究證實，Notch信號通路的激活會促進肺癌的進展，NOTCH1蛋白表達水平升高與肺癌患者的預后不良有關[21]。NOTCH1蛋白是一種轉錄因子，其不但會促進增殖和轉移相關蛋白的轉錄，還可以提高IL-6和TGF-β1等免疫相關因子的表達水平[22]。研究顯示，Gal-3表達水平降低會抑制Notch通路，并干擾B淋巴細胞的分化[23]。此外，Gal-3可通過激活Notch信號通路促進血管生成，從而促進腫瘤進展[24]。為進一步分析Gal-3促進肺癌進展的作用機制，本研究檢測了Gal-3對Notch通路的調控作用，以及該作用對肺癌細胞生物學行為和免疫相關因子表達水平的影響。結果顯示，Gal-3組的NOTCH1蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)，說明過表達Gal-3可以促進NOTCH1蛋白的表達水平，對Notch信號通路具有一定調控作用。而Gal-3+LY450139組細胞的NOTCH1蛋白水平、增殖活力、侵襲能力、IL-6和TGF-β1 mRNA水平均低于Gal-3組但高于LY450139組，凋亡率高于Gal-3組，但低于LY450139組(均P<0.05)，說明使用LY450139抑制Notch通路，可以抑制A549細胞的增殖、侵襲能力及IL-6、TGF-β1的表達，促進A549細胞的凋亡，阻斷Gal-3的促癌作用，這也提示Gal-3可能通過調控Notch信號通路來促進肺癌細胞的生物學行為及增強肺癌細胞的免疫抑制。

綜上所述，Gal-3可能通過調控Notch信號通路來提高肺癌細胞的增殖和侵襲能力，并促進免疫相關因子IL-6和TGF-β1的表達，從而參與肺癌的進展。Gal-3可能成為治療肺癌的新靶點。