miR-486-3p靶向DDR1對口腔鱗狀細胞癌的抑制作用及檳榔致口腔鱗狀細胞癌的可能機制▲

唐乃高 鄭根建

(海南醫學院第一附屬醫院口腔科，海南省海口市 570100)

2020年，全球唇及口腔癌的新發病例數約377 713例，死亡病例數約177 757例[1]。口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常見的口腔癌病理類型。手術治療、放化療及靶向治療是OSCC的常見治療手段，這些方法均具有一定的療效，但在改善OSCC患者預后方面效果欠佳[2]。酒精、檳榔和香煙是OSCC最常見的致病因素[3]，其中咀嚼檳榔被公認為是導致OSCC的最主要因素[4]。了解咀嚼檳榔所致的OSCC臨床特征，對于尋找OSCC的新治療靶點和改善患者預后具有重要意義。

研究顯示，miR-486-3p在急性冠狀動脈綜合征、銀屑病、高血壓和代謝綜合征等多種疾病中發揮重要作用[5-7]。 miR-486-3p還可以通過抑制多種癌細胞的遷移和侵襲，發揮腫瘤抑制作用[8]，如miR-486-3p通過靶向細胞外基質蛋白1抑制視網膜母細胞瘤的增殖、遷移和侵襲，以及宮頸癌細胞的增殖和轉移[9-10]。盤蛋白結構域受體-1(discoidin domain receptor-1，DDR1)是盤蛋白結構域受體亞家族的成員，屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族，在基質重塑、膠原蛋白的產生和降解、細胞增殖、細胞分化及細胞黏附等多種細胞功能中發揮著關鍵的作用[11]。已有文獻報告DDR1在肺癌[12]、乳腺癌[13]、腦癌[14]、口腔癌[8]和肝癌[15]等多種人類腫瘤中異常表達及被激活。本研究探討miR-486-3p通過靶向DDR1抑制嚼檳榔所致OSCC的作用機制，以期為臨床上治療OSCC提供新思路。

(2)邀請老黨員參加一個或幾個學生支部“三會一課”，加強對學生黨員組織生活的指導，講好黨課，做好黨建重點任務，并計劃擴展到邀請校內外有豐富經驗的老黨務工作者。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗細胞：人口腔表皮癌(oral epidermal carcinoma,OEC)-M1細胞系，正常口腔角質形成細胞系OKF4/TERT-1，以及用于熒光素酶實驗的工具細胞—人胚胎腎細胞系HEK293，均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 實驗試劑：EdU細胞增殖試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA331-1000)；反轉錄試劑盒(Invitrogen公司，批號：11750150)；甘氨酸(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：G274229)；Hoechst染色試劑盒(Bioworld公司，批號：33342)；QuantiTect SYBR Green試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR820A)；TRIzol試劑盒(TaKaRa公司，批號：108-95-2)；pmirGLO螢火蟲熒光素酶表達載體(Addgene公司，批號：117339)；雙熒光素酶報告基因檢測系統(30IOC化學發光測試儀，Progema公司)；定點誘變試劑盒(TaKaRa公司，批號：R401)；LipofectamineTM2000轉染試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號：11668500)；二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒(TaKaRa公司，批號：T9300A-3)；蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司，批號：26617)；胎牛血清(BI公司，批號：04-010-1ACS)；DMEM(Gibco公司，批號：10-013-CVR)；Opti-MEM(Gibco公司，批號：31985-062)；青霉素鏈霉素混合液(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGY0023)；DDR1抗體(ABclonal公司，批號：A10487)、Caspase-3抗體(ABclonal公司，批號：A2156)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體(ABclonal公司，批號：A2931)、GAPDH抗體(ABclonal公司，批號：A19056)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(Jackson公司，批號：111-035-003)；Triton X-100(Solarbio公司，批號：T8200)；T4連接酶(Sigma-Aldrich公司，批號：D2886)；Polybrene試劑(上海懋康生物科技有限公司，批號：GM-040901A)。所有PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司和廣州銳博生物技術有限公司合成；miR-486-3p mimic、miR-486-3p inhibitor、OE-DDR1慢病毒質粒及sh-DDR1慢病毒質粒均由生工生物(上海)股份有限公司合成；慢病毒包裝質粒(psPAX2、PMD2.G)由Addgene公司合成。檳榔堿(純度98%，Acros Organics公司，批號：300-08-3)。

1.2 方法

2.2 miR-486-3p對OSCC細胞增殖和凋亡相關蛋白表達水平的影響 與對照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細胞EdU陽性細胞比例降低，cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，而miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細胞EdU陽性細胞比例增高，cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低(均P<0.05)。3組的Caspase-3蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

1.2.2 細胞培養及轉染

1.2.2.1 細胞培養：OEC-M1細胞、OKF4/TERT-1細胞、HEK293細胞均培養于含10%胎牛血清及1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養中。

1.2.2.2 瞬染：取對數生長期OEC-M1細胞，用胰酶消化后接種于6孔細胞培養板(接種密度為1×106個/孔)，待細胞生長融合至80%后，嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行轉染操作。將細胞分為3組進行干預：對照1組，常規培養細胞，不給予任何特殊處理；miR-486-3p mimic組，給予50 nmol/L的miR-486-3p mimic處理48 h；miR-486-3p inhibitor組，給予100 nmol/L的miR-486-3p inhibitor處理48 h。各組細胞均培養于37 ℃、5% CO2孵育箱中。

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二是依申請信息公開標準化。制定落實政務信息主動公開制度，公開了財政部門預決算、政府性基金和行政事業性收費目錄、規范性文件、財政政策等信息，推進部門預決算和“四本預算”全公開。完善內部工作流程和法定程序，制定《財政政府信息依申請公開標準化管理》，規范答復格式文書，將答復流程嵌入辦公自動化。

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1.2.3 實時熒光定量PCR：收集組織(組織采用搗碎器進行搗碎)及各組細胞，采用TRIzol法提取總RNA，然后將RNA進行反轉錄得到cDNA。使用PCR儀擴增miR-486-3p及內參U6。擴增體系為2×miRcute mirRNA premix 10 μL+反轉錄引物0.2 μL+miR-486-3p/U6上下游引物各0.5 μL+cDNA 1.0 μL+RNase Free H2O 7.8 μL，共計20 μL。反應條件為94 ℃ 2 min，1個循環；94 ℃ 20 s，40個循環；72 ℃ 10 min。miR-486-3p上游引物序列為5′-GAGTGTCGGGGCAGCTCAGT-3′，下游引物序列為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用PCR儀擴增DDR1及內參GAPDH，擴增體系為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL+DDR1/GAPDH上下游引物各1 μL+cDNA 2 μL+RNase Free H2O 8.5 μL，共25 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，總循環40次；73 ℃延伸5 min。DDR1上游引物序列為5′-GTTCCTGGCGGATGATG-3′，下游引物序列為5′-GGGAATGGGCAAGTATGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列為5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG -3′。采用2-ΔΔCt法計算miR-486-3p、DDR1 mRNA的相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.4 EdU染色：用DMEM(含10%胎牛血清及1%青霉素鏈霉素混合液)按1 000 ∶1的比例稀釋EdU A液，以制備50 μmol/L EdU培養基。取對數生長期各組細胞，每孔加入100 μL的50 μmol/L EdU培養基，孵育2 h后棄培養基，用PBS輕洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL細胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)，室溫孵育30 min后棄固定液，用PBS輕洗3次，5 min/次。采用0.5% Triton X-100室溫破膜20 min，PBS輕洗3次，5 min/次。每孔加入200 μL的2 mg/mL甘氨酸，在脫色搖床上孵育5 min后棄甘氨酸溶液，用PBS輕洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL的1×Appollo染色反應液，避光、室溫下在脫色搖床上孵育30 min，棄染色反應液。每孔加入100 μL甲醇輕洗2次，5 min/次。用去離子水按100 ∶1的比例稀釋制備1×Hoechst反應液，避光孵育20 min，棄1×Hoechst反應液，用PBS輕洗3次，5 min/次。使用熒光顯微鏡(Leica公司，型號：DM2500)進行觀察，陽性細胞在顯微鏡下呈綠色。每組隨機選取10個視野，計算每個視野下陽性細胞占總細胞的比例，取平均值為該組EdU陽性細胞比例，用于表示細胞增殖能力。實驗重復3次。

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1.2.5 生物信息學分析：采用TargetScan數據庫(https://www.targetscan.org/vert_80/)進行miR-486-3p與DDR1的預測位點分析。首先輸入miR-486-3p，然后以|log2FC|≥2且P<0.05作為篩選條件，找到DDR1基因，點擊DDR1基因即可顯示miR-486-3p與DDR1基因的結合位點。

1.2.2.3 穩轉：(1)取對數生長期HEK293細胞，用胰酶消化后接種于6孔細胞培養板(接種密度為1×106個/孔)，待細胞生長融合至80%后進行轉染操作。嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書，將2 μg OE-DDR1慢病毒質粒+1.6 μg psPAX2+2.4 μg PMD2.G轉染至HEK293細胞，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中繼續培養，48 h后以1 000 r/min離心10 min，取上清液(即病毒液)，并保存于-20 ℃冰箱待用。(2)取對數期OEC-M1細胞，用胰酶消化后接種于6孔細胞培養板(接種密度為1×106個/孔)，并分為對照2組、OE-DDR1組、sh-DDR1組。待細胞生長融合至80%后，棄去原細胞培養基，對各組細胞進行干預。將2 mL DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素混合液)+1 mL病毒液(加入先前融化的病毒液)+1 μL Polybrene試劑加入OE-DDR1組6孔細胞培養板中，構建OE-DDR1-OEC-M1穩轉株；按照上述方法對sh-DDR1組細胞構建sh-DDR1-OEC-M1穩轉株；對照2組細胞正常培養，不進行干預。

2.3 DDR1對OSCC細胞增殖和凋亡相關蛋白表達水平的影響 與對照2組相比，sh-DDR1組OEC-M1細胞EdU陽性細胞比例降低，cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，而OE-DDR1組OEC-M1細胞EdU陽性細胞比例升高，cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低(均P<0.05)。3組的Caspase-3蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

1.2.7 Western blot檢測：使用蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白，4 ℃下3 000 r/min離心30 min，棄沉淀，保留上清液，采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量。各組取5 μg的蛋白上清液，加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液并于金屬浴中加熱變性5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠及濃縮膠配置完成后，加入7 μL的蛋白樣品進行電泳。待電泳結束后，以300 mA恒流進行濕轉轉膜，將蛋白轉型PVDF膜后，5%脫脂牛奶于室溫下封閉PVDF膜2 h后，TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀釋后的Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、DDR1抗體(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)室溫振蕩1 h，TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加電化學發光液，于凝膠成像儀進行曝光拍照。采用Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

通過思想政治理論課教學能使教師自身的教學指導能力與科研能力得到不斷提高；促使教師更加全面、深入地接觸和了解社會，拓寬了教師的視野，以便他們能夠尋找更具有價值的科研和教研課題，進一步增強廣大高校教師的科研意識，全面提高他們的科研能力。目前，我們的許多思想政治課教師只做到了“教書”，卻忽視了“育人”。而在理論課教學過程中，教師不僅能夠在教學中發現問題，還能夠根據學生的反饋不斷地完善自身的教育教學，繼而明確教學的方向，加快創新步伐，并最終切實地提高思想政治理論課教學的實效性。

1.2.2.4 檳榔堿干預OKF4/hTERT細胞的方法：取生長融合至80%的OKF4/hTERT細胞，接種于24孔細胞培養板，將細胞隨機分為無檳榔堿組和檳榔堿組，無檳榔堿組常規培養細胞，不給予任何特殊處理；檳榔堿組給予100 μmol/L的檳榔堿連續刺激細胞5 d。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-486-3p在OSCC組織中的表達情況 癌旁組織中的miR-486-3p相對表達水平為(1.08±0.21)，OSCC組織中miR-486-3p相對表達水平為(0.48±0.17)，后者低于前者(t=9.931，P<0.001)。

1.2.1 OSCC組織標本的獲取：收集20例原發性OSCC患者的腫瘤組織及癌旁組織(距離腫瘤病灶2 cm的組織)，保存于液氮中備用。患者及其家屬已簽署知情同意書。本研究已經過海南醫學院第一附屬醫院人體實驗和倫理委員會的審查和批準。

圖1 miR-486-3p對OSCC細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

1.2.6 雙熒光素酶實驗：將包含miR-486-3p靶序列的DDR1片段的整個3端非翻譯區(3′ untranslated region,3′UTR)進行PCR擴增。擴增體系為25 μL 2×rTaq酶+1 μL cDNA+1 μL 10 μmol/L引物+23 μL滅菌水，共50 μL。擴增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；4 ℃保存。上游引物序列為5′-GTGATGGAGATGGGGCTT-3′，下游引物序列為5′-TCGGGAGAACTCTTTGCC-3′。使用T4連接酶將擴增后的片段克隆到pmirGLO螢火蟲熒光素酶表達載體中，構建DDR1-3′UTR-WT載體，在此基礎上使用定點誘變試劑盒，構建miR-486-3p與DDR1的結合位點點突變載體(DDR1-3′UTR-MUT)，并進行DNA測序驗證。將OEC-M1細胞分為DDR1-3′UTR-WT+miR-486 3p-mimic組、DDR1-3′UTR-MUT+miR-486-3p mimic組，使用LipofectamineTM2000轉染試劑將上述載體和20 μmol/L miR-486-3p mimic轉染至兩組OEC-M1細胞中。同時設立DDR1-3′UTR-WT+對照1組，只轉染DDR1-3′UTR-WT載體。48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測各組細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

表2 DDR1對OSCC細胞增殖和凋亡相關蛋白相對表達水平的影響(x±s)

圖2 DDR1對OSCC細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

2.4 miR-486-3p在OSCC中靶向調控DDR1的表達 在TargetScan數據庫中分析發現，miR-486-3p與DDR1存在結合位點；轉染后，miR-486-3p與DDR1-3′-UTR-WT存在結合點，而與DDR1-3′-UTR-MUT不存在結合點，見圖3。雙熒光素酶實驗結果顯示，與DDR1-3′UTR-WT+對照1組相比，DDR1-3′UTR-WT+miR-486-3p mimic組的熒光素酶活性下降(P<0.05)，而DDR1-3′UTR-MUT+miR-486-3p mimic組的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。實時熒光定量PCR結果顯示，與對照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細胞的DDR1 mRNA表達水平降低，miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細胞的DDR1 mRNA表達水平升高(P<0.05)，見表4。

起初，專家們認為阿爾茨海默病源于基因異常。美國科技暢銷書《基因戰爭》就是從該病入手探討人類基因組計劃的。科學研究亦證實，發生在人體第21條染色體上的變異，可導致阿爾茨海默病，該原因引發的病癥有50%的概率遺傳到下一代，這種由遺傳因素導致的病癥，其發病年齡也通常較早。然而進一步的研究表明，基因異常導致的發病只是極少數情況，大部分阿爾茨海默病并不遺傳，其原因通常較為復雜：飲食習慣、職業與經濟狀況、甚至頭部遭受重擊都可以導致發病。全球65歲以上的老人中，平均每20個人中就有一個患有阿爾茨海默病，由于發病率高，一個家庭中有不止一個病人的情況也較為普遍，因此會造成遺傳的錯覺。

圖3 miR-486-3p與DDR1存在結合位點

表3 各組OEC-M1細胞熒光素酶活性檢測結果(x±s)

表4 miR-486-3p對OEC-M1細胞DDR1 mRNA表達水平的影響(x±s)

2.5 檳榔堿對OKF4/TERT-1細胞miR-486-3p和DDR1表達水平的影響 與無檳榔堿組相比，檳榔堿組OKF4/TERT-1細胞中miR-486-3p表達水平降低，DDR1 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 兩組OKF4/TERT-1細胞miR-486-3p、DDR1 mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖4 兩組OKF4/TERT-1細胞中DDR1蛋白的表達情況

3 討 論

miRNA參與人類多種疾病，可通過與靶基因的3′UTR結合，在轉錄后水平上調控靶基因的表達[16]。miR-486-3p作為腫瘤抑制因子，通過抑制多種致癌基因的表達在腫瘤細胞的增殖和轉移中發揮關鍵作用。既往研究結果顯示，miR-486-3p在甲狀腺乳頭狀癌[17]、視網膜母細胞瘤[8]、宮頸癌[18]、膀胱[19]中異常表達。但是，有關miR-486-3p對OSCC的影響及其機制目前尚未完全清楚。本研究結果顯示，與癌旁組織相比，OSCC組織中miR-486-3p表達水平降低(P<0.05)，說明miR-486-3p可能參與OSCC的發病過程。此外，與對照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細胞增殖能力降低，cleaved Caspase-3表達水平升高，而miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細胞增殖能力增高，cleaved Caspase-3表達水平降低(均P<0.05)。Caspase是一類與凋亡密切相關的蛋白水解酶家族,以Caspase前體酶原的形式存在于大多數動物的細胞中。Caspase-3被切割活化后變成cleaved Caspase-3，但cleaved Caspase-3僅存在于正在發生凋亡的細胞中，未凋亡或已經壞死的細胞中檢測不出cleaved Caspase-3。因此，該結果說明miR-486-3p可以抑制OSCC細胞增殖，促進OSCC細胞凋亡，從而發揮抑制腫瘤的作用。

羊多殺性巴氏桿菌感染引起的巴氏桿菌病應該結合藥敏試驗，選擇高敏抗生素進行治療，選擇使用硫酸卡那霉素注射液、地塞米松磷酸鈉注射液，使用劑量分別為1.5萬IU/kg體重、4 mg/只羊，混合后肌肉注射，1次/d，連續使用3 d[2]。同時在飲用水中添加0.1%的氟哌酸，讓患病羊自由飲水。對于體溫升高、不能正常進食、病情較為嚴重的患病羊，選擇使用30%的安乃近注射液5 mL、5%的糖鹽水500 mL、維生素C5 mL，混合后靜脈注射，1次/d，連續使用3 d，強化補液[3]。

DDR1在多種腫瘤患者體內呈高表達，并作為腫瘤蛋白在腫瘤細胞的生存、增殖、耐藥、侵襲性和遷移等過程中發揮作用[20]。高水平的DDR1可通過激活Notch受體1和Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶信號通路提高腫瘤細胞的生存能力[21]。本研究結果顯示，與對照2組相比，sh-DDR1組OEC-M1細胞增殖能力降低，cleaved Caspase-3表達水平升高，而OE-DDR1組OEC-M1細胞增殖能力升高，cleaved Caspase-3表達水平降低(均P<0.05)，說明抑制DDR1表達可以抑制OSCC細胞增殖，促進OSCC細胞凋亡。這提示DDR1在OSCC細胞生存中發揮了重要的作用，這為未來研究DDR1對OSCC細胞生存的影響及相關機制提供了框架。

本研究結果還顯示，與對照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細胞的DDR1 mRNA表達水平降低，miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細胞的DDR1 mRNA表達水平升高(均P<0.05)；此外，雙熒光素酶實驗結果和生物信息學分析顯示，miR-486-3p與DDR1存在結合位點，說明miR-486-3p可以直接通過與DDR1 3′UTR結合來下調DDR1的表達，從而發揮抑癌作用。

咀嚼檳榔是導致口腔黏膜纖維化的最主要原因，可增加口腔癌發病率，還與口腔白斑和口腔扁平苔蘚等癌前病變密切相關[22]。有研究顯示，檳榔是臺灣地區人群患口腔癌最常見的環境危險因素[23]。咀嚼檳榔致口腔癌的原因可能是因為檳榔的多種活性成分和代謝產物(包括檳榔生物堿、檳榔鞣質、檳榔特異性亞硝胺和活性氧等)具有細胞毒性、遺傳毒性，甚至直接致癌性[24]。本研究結果顯示，與無檳榔堿組相比，檳榔堿組OKF4/TERT-1細胞中的miR-486-3p表達水平降低，DDR1 mRNA和蛋白表達水平升高(均P<0.05)，說明檳榔可能通過調控miR-486-3p和DDR1的表達從而引起口腔癌的發病。

綜上所述，OSCC組織中miR-486-3p表達水平降低，miR-486-3p可能通過靶向下調DDR1的表達，抑制OSCC細胞增殖，促進OSCC細胞凋亡，進而發揮抑癌作用。檳榔堿可下調正常口腔角質形成細胞中miR-486-3p的表達，而上調DDR1的表達，檳榔可能通過調控miR-486-3p和DDR1的表達從而誘發口腔癌。本研究結果或許可為臨床上治療咀嚼檳榔所致的OSCC提供了新的思路。