強(qiáng)舒降壓方對(duì)L-NAME誘導(dǎo)大鼠高血壓的干預(yù)作用及其機(jī)制

黃自通，楊偉韜，黃曉霞，王紅剛，周敏華，羅蘭

（1.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 佛山 528200）

高血壓屬于一種慢性病，臨床上可引起腦卒中、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病，同時(shí)高血壓還會(huì)誘導(dǎo)一些并發(fā)癥如腎病、肝病，是威脅人類健康的重要因素[1]。2017年中國約3.2 億的中老年人患有高血壓，高血壓已成為危害中老年人健康的重大公共衛(wèi)生問題[2-4]。FDA 批準(zhǔn)的降壓藥不良反應(yīng)涉及血管性水腫、咳嗽、腎功能障礙和高鉀血癥等[5-6]。近年來，人們開始將研究治療高血壓的目光轉(zhuǎn)向中醫(yī)藥，并篩選出了一批具有降血壓作用的單味中藥和方劑，如葛根、山綠茶、心肌爾康、平肝潛陽湯、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯[7-12]等。通過中藥給藥，不僅可以減緩甚至抑制高血壓的發(fā)生，而且還可治愈高血壓，一定程度上提高患者的生活質(zhì)量，對(duì)于高血壓的治療具有極大的潛力[7-12]。

強(qiáng)舒降壓方（QJF）是本題組根據(jù)臨床用藥及文獻(xiàn)總結(jié)的基礎(chǔ)上，在臨床中醫(yī)醫(yī)生的指導(dǎo)下化裁的一個(gè)降壓處方，在應(yīng)用中具有很好的降壓作用。該方由川牛膝、山綠茶、仙靈脾、杜仲、葛根5味中藥組成。本實(shí)驗(yàn)通過研究QJF 對(duì)由N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME）引起的NO 缺乏而誘導(dǎo)的高血壓大鼠血壓的影響及相關(guān)作用機(jī)制的探討，為臨床用藥提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食、飲水，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大鼠房，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理要求，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守中華人民共和國的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 藥材與試劑

川牛膝、仙靈脾、杜仲、葛根均產(chǎn)于四川，山綠茶產(chǎn)于廣西上林，由廣東藥科大學(xué)王紅剛高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為正品。L-NAME（上海源葉生物科技有限公司）；卡托普利（國藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司）；內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等ELISA 分析試劑盒，均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

MD3000生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)及DB128無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）；TC-150B/Q 脫水機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）；MPW-352R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（廣州華啟運(yùn)精密儀器有限公司）；BA310-T 生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；TR-180I自動(dòng)染色機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）；PTX-FA2105L 電子天平[華志（福建）電子科技有限公司]。

2 方法

2.1 藥液的制備

將川牛膝、山綠茶、仙靈脾、杜仲、葛根分別粉碎后過20 目篩，按3.34∶1∶5∶5∶5 的質(zhì)量比混合，料液比1∶20（g/mL）加蒸餾水浸泡4 h，熱回流提取3次，提取液過濾后合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，待用。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將60 只大鼠隨機(jī)分成5 組，分別為模型組（LNAME 50 mg/kg）[13]、高劑量組（L-NAME 50 mg/kg+QJF 12 g/kg）、低劑量組（L-NAME 50 mg/kg+QJF 6 g/kg）、陽性組（L-NAME 50 mg/kg+卡托普利10 mg/kg）及空白組，每組12 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，配制低劑量組質(zhì)量濃度為0.27 g/mL 的藥液，高劑量組為0.54 g/mL 的藥液，L-NAME 濃度為0.005 g/mL，于每天上午10 點(diǎn)灌胃給藥，給藥劑量為1 mL/100 g，1天1次，連續(xù)灌胃4周。

2.3 血壓測(cè)量

大鼠固定于37 ℃恒溫、安靜的籠具中，使用無創(chuàng)血壓測(cè)量分析儀測(cè)量大鼠的收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和心率（HR），每周測(cè)量大鼠血壓1 次，每次連續(xù)測(cè)血壓5次，取平均值。

2.4 取材

實(shí)驗(yàn)第4 周時(shí)，于最后1 次給藥1 h 后，10%（φ）水合氯醛0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，取胸主動(dòng)脈、心臟、腎臟等。

2.5 形態(tài)學(xué)觀察

取胸主動(dòng)脈并除去周圍的結(jié)締組織，置于包埋盒放入10%（φ）甲醛溶液中固定，固定時(shí)間為48 h以上。經(jīng)過脫水后將血管切成小段，修整齊，接著包埋和切片，脫蠟后進(jìn)行HE染色，用×400的生物顯微鏡觀察組織形態(tài)、細(xì)胞大小等，并攝片。

2.6 血清中的指標(biāo)檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血4 mL注入普通真空采血管，靜止30 min 后，4 000 r/min 冷凍離心15 min，取血清，ELISA 檢測(cè)其ET-1、vWF、TNF-α、eNOS 的含量，數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.7 血漿NO含量的測(cè)定

步驟同“2.6”項(xiàng)下，腹主動(dòng)脈取血3 mL 注入肝素鈉真空采血管，靜止30 min后，3 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液得到血漿，ELISA 檢測(cè)血漿NO的含量，均重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.8 組織勻漿指標(biāo)測(cè)定

大鼠取血后，從左心室插入針管并用生理鹽水對(duì)心臟進(jìn)行灌流，并摘除心臟、腎臟，迅速放到液氮中凍存。對(duì)心臟、腎臟分別勻漿、離心，取上清液，ELISA 檢測(cè)心臟MMP-9、腎臟TNF-α的含量。以上數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，用GraphPad Prism8 繪圖統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 QJF對(duì)高血壓大鼠血壓的影響

由表1可知，第1～4周，與空白組相比，模型組大鼠經(jīng)L-NAME 誘導(dǎo)后SBP、DBP 均顯著升高（P<0.05，P<0.01））；從第2 周開始，QJF 干預(yù)組的SBP、DBP 與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01 或P<0.05）；卡托普利組與QJF 高劑量組的SBP<140 mmHg，效果顯著（P<0.01）。心率1～4 周差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 QJF對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠SBP、DBP及HR的影響Table 1 Effect of QJF on SBP，DBP and HR in L-NAME-induced hypertensive rats(±s,n=12)

表1 QJF對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠SBP、DBP及HR的影響Table 1 Effect of QJF on SBP，DBP and HR in L-NAME-induced hypertensive rats(±s,n=12)

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

第4周106.59±5.36 86.61±3.81 356±12.40 158.43±8.31**128.21±6.96**338±11.41 128.55±7.89##99.22±4.37##338±18.91 145.29±10.63#109.99±5.88##328±7.50 137.96±7.95##116.20±8.03##341±4.54組別空白組模型組卡托普利組QJF低劑量組高劑量組指標(biāo)SBP/mmHg DBP/mmHg HR/（次·min-1）SBP/mmHg DBP/（次·min-1）HR/mmHg SBP/mmHg DBP/（次·min-1）HR/mmHg SBP/mmHg DBP/（次·min-1）HR/mmHg SBP/（次·min-1）DBP/mmHg HR/mmHg第1周101.03±6.32 81.12±3.32 367±13.72 113.36±8.02*84.54±6.99 338±16.53 111.32±9.18 85.32±1.69 354±11.12 114.20±8.41 80.57±3.31 330±6.06 115.45±9.15##90.67±3.16 343±11.69第2周105.42±7.19 78.53±2.87 369±16.34 138.98±15.93**91.37±8.73**353±7.38 117.66±7.46##89.05±4.46 ##354±18.32 120.63±7.53#85.34±3.23##339±10.61 116.49±8.06##89.24±4.30##347±16.55第3周106.42±11.03 80.43±5.71 353±11.20 153.2±18.11**117.46±9.71**346±6.69 120.48±9.77##97.68±4.36##357±16.06 125.37±13.09##98.30±8.72##337±13.87 129.80±12.02##107.7713±6.11##331±14.87

3.2 QJF 對(duì)L-NAME 誘導(dǎo)高血壓鼠血漿NO 含量的影響

由圖1可知，模型組大鼠血漿NO含量較空白組顯著降低（P<0.01），QJF 干預(yù)的低劑量組及高劑量組血漿NO 含量較模型組顯著升高（P<0.01），卡托普利組NO 含量亦高于模型組（P<0.01），QJF 高劑量組NO含量與卡托普利組相當(dāng)。

圖1 QJF對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓鼠血漿中NO含量的影響Figure 1 Effect of QJF on plasma NO content in L-NAMEinduced hypertensive rats(±s,n=12)

3.3 QJF 對(duì)L-NAME 誘導(dǎo)高血壓大鼠血清中ET-1、vWF、TNF-α、eNOS含量的影響

由圖2可知，模型組大鼠血清中ET-1、vWF、TNF-α含量較空白組顯著升高（P<0.01），eNOS 較空白組顯著降低（P<0.01）。QJF 低劑量組、高劑量組和卡托普利組的ET-1、vWF、TNF-α較模型組顯著降低（P<0.01），eNOS較模型組顯著升高（P<0.01）。

圖2 QJF 對(duì)L-NAME 誘導(dǎo)高血壓大鼠血清ET-1、vWF、TNF-α、eNOS含量的影響Figure 2 Effect of QJF on the content of serum ET-1，vWF，TNF-α and eNOS in L-NAME-induced hypertensive rats（±s,n=12）

3.4 QJF 對(duì)L-NAME 誘導(dǎo)高血壓大鼠心臟、腎臟勻漿中TNF-α、MMP-9含量的影響

由圖3可知，模型組大鼠腎臟中的TNF-α含量較空白組顯著升高（P<0.01），QJF 低劑量組與高劑量組的腎臟TNF-α含量較模型組顯著降低（P<0.01），并與卡托普利組效果相當(dāng)。QJF低劑量組與高劑量組的MMP-9含量較模型組顯著降低（P<0.01）。

圖3 QJF 對(duì)L-NAME 誘導(dǎo)高血壓大鼠心臟MMP-9、腎臟TNF-α含量含量的影響Figure 3 Effect of QJF on the content of renal TNF-α and cardiac MMP-9 in L-NAME-induced hypertensive rats（±s,n=12）

3.5 形態(tài)學(xué)觀察

由圖4可知，空白組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜完整，中膜厚度適中，肌纖維排列有序，未見血管平滑肌細(xì)胞增生，細(xì)胞核大小相近；模型組血管內(nèi)膜連續(xù)性差，肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核大小不均，存在鈣化現(xiàn)象；卡托普利組和低劑量組、高劑量組干預(yù)后，內(nèi)膜的連續(xù)性、肌纖維排列紊亂及細(xì)胞核大小不均等情況較模型組均有所改善。

圖4 QJF對(duì)L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠胸主動(dòng)脈病理學(xué)的影響Figure 4 Effect of QJF on pathology of thoracic aorta in LNAME-induced hypertensive rats（HE，400×）

4 討論

高血壓隨年齡增高而患病率明顯增加，多發(fā)于中老年。中醫(yī)認(rèn)為，高血壓多為本虛標(biāo)實(shí)之證，其病位在肝，根源在腎。腎氣虧虛，精髓不足，水不涵木，肝陽亢于上，進(jìn)而導(dǎo)致五臟功能失調(diào)，出現(xiàn)各種變證。臨床表現(xiàn)為頭暈、頭重、頭痛、健忘失眠、煩躁、視物昏花、腰膝酸軟、耳鳴耳聾、性功能衰退，都反映了高血壓病的腎虛的客觀存在。故本方選用杜仲、仙靈脾、川牛膝以滋補(bǔ)肝腎，陰陽平補(bǔ)，以顧其本；輔以葛根升陽通經(jīng)活絡(luò)之功，另用山綠茶清熱平肝之效，各藥相互配合，達(dá)到補(bǔ)肝腎、化瘀血、清肝火及降血壓的目的。強(qiáng)舒降壓方中各味藥均具有較好的降壓作用[18-22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，QJF具有很好干預(yù)大鼠的收縮壓、舒張壓及大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)作用。NO 是一種內(nèi)源性舒張因子，由eNOS 催化合成，對(duì)心血管系統(tǒng)各種生理和病理生理過程起著重要作用。由L-NAME 誘導(dǎo)的高血壓模型使機(jī)體缺乏NO的情況下很容易發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。有文獻(xiàn)表明[23]，NO 主要是通過擴(kuò)張血管、抑制平滑肌細(xì)胞的增生，從而發(fā)揮降低血壓的作用，NO 還能阻止血細(xì)胞與血細(xì)胞及血細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏連，使血流通暢。權(quán)赫秀等[24]使用L-NAME 抑制eNOS活性，減少NO 合成時(shí)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞破碎雜亂，SOD 活性減弱，血壓升高等現(xiàn)象。ET-1 是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，維持基礎(chǔ)的血管張力和心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性，當(dāng)體內(nèi)血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙時(shí)，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成ET-1增加，導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)功能紊亂，血管重構(gòu)。謝祥紅[25]研究原發(fā)性高血壓患者血漿中ET-1變化發(fā)現(xiàn)，ET-1含量與24 h血壓呈正相關(guān)，比健康人群體內(nèi)含量高，其可能是血壓升高的另一個(gè)主要因素。vWF 由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，被作為高特異性和高敏感性血管內(nèi)皮損傷標(biāo)記物，是血栓形成與止血過程中的主要糖蛋白之一，且具有血管內(nèi)皮細(xì)胞特異源性，故被認(rèn)為是內(nèi)皮損傷的有效標(biāo)志物。本研究中卡托普利組與QJF治療組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明L-NAME 誘導(dǎo)的高血壓對(duì)血管的影響較大，會(huì)造成血管壁增厚、血管損傷、甚至血管重構(gòu)，QJF 對(duì)血管具有保護(hù)作用。QJF 可顯著升高大鼠體內(nèi)eNOS 的含量，降低血清中ET-1、vWF 的含量。MMP-9 與高血壓病程中的心臟重構(gòu)密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在心肌肥大和心肌纖維化兩方面[26]。駱露媛[27]通過兩腎兩夾模型，研究MMP-9在腎血管性高血壓中的發(fā)病機(jī)制發(fā)現(xiàn)，特異性抑制MMP-9 的表達(dá)可有效降低腎血管性高血壓大鼠的血壓，在血管重構(gòu)方面亦有關(guān)聯(lián)，推斷MMP-9是高血壓發(fā)生的重要原因。因此，本研究中強(qiáng)舒降壓方的降壓機(jī)制可能與抑制心臟MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

高血壓腎病是高血壓并發(fā)癥之一，通過腎臟的氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種因子，如NF-kB，形成腎臟炎癥狀態(tài)[28]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，劉振岳等[29]研究結(jié)果表明，炎癥損傷這一現(xiàn)象貫穿了高血壓病發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程，是高血壓病發(fā)生發(fā)展中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，而TNF-α為炎癥因子家族中的促炎因子。本研究中，模型組腎臟勻漿的TNF-α較QJF治療組顯著升高，提示腎臟存在炎癥，炎癥過程與高血壓的發(fā)生相關(guān)，因此檢測(cè)TNF-α含量有利于探討高血壓病中的炎癥損傷程度。

同時(shí)，由于L-NAME 通過抑制eNOS 活性來阻斷NO 形成，進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)性系統(tǒng)高血壓，造成血管內(nèi)皮功能障礙及心臟重構(gòu)[30]。胸主動(dòng)脈病理切片結(jié)果表明，QJF干預(yù)組在內(nèi)膜連續(xù)性、肌纖維排列、細(xì)胞核大小等方面均有改善。與檢測(cè)的ET-1、vWF、NO指標(biāo)相對(duì)應(yīng)，主要通過改變血管形態(tài)而達(dá)到降壓的作用。

綜上，QJF 能降低L-NAME 誘導(dǎo)的高血壓大鼠的血壓，其機(jī)制可能是通過提高NO、eNOS 含量，抑制脂質(zhì)過氧化損傷和血管損傷，降低ET-1、vWF、TNF-α、MMP-9 含量。本實(shí)驗(yàn)通過藥物的配伍使用，為降血壓藥物的開發(fā)提供了新的途徑，同時(shí)也為臨床用藥提供參考。