基于G1-熵權(quán)法和正交設(shè)計(jì)多指標(biāo)優(yōu)化血脈疏通顆粒的提取工藝

陳雪婷，徐文杰，李潔環(huán)，馮健英，李智勇，張建軍

[廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510095]

血脈疏通方作為廣東省第二中醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，已在臨床應(yīng)用達(dá)10年之久，用于改善動(dòng)脈粥樣硬化、斑塊形成及冠心病、心絞痛、肢體麻木、活動(dòng)不利等，效果顯著[1]。動(dòng)脈硬化及斑塊形成，多因氣虛血瘀，痰濁瘀血阻滯經(jīng)脈，導(dǎo)致血脈不通，為本虛標(biāo)實(shí)之證。治療當(dāng)以補(bǔ)氣活血、化痰通脈，標(biāo)本兼治。血脈疏通方由黃芪、陳皮、黨參等十味中藥組成，全方共湊補(bǔ)氣化痰、消瘀通脈之功。原湯劑內(nèi)服，存在攜帶、服用、保存不便的問(wèn)題，為更好的滿(mǎn)足現(xiàn)代人的用藥需求，提高病人順應(yīng)性，現(xiàn)擬將其制備為顆粒劑。

G1 法是對(duì)層次分析法（AHP）進(jìn)行改進(jìn)的一種主觀賦權(quán)法，具有計(jì)算速度快、無(wú)需一致性檢驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，而熵權(quán)法則是一種客觀賦權(quán)法，根據(jù)各指標(biāo)的變異程度，利用信息熵計(jì)算出各指標(biāo)的熵權(quán)，再通過(guò)熵權(quán)對(duì)各指標(biāo)的權(quán)重進(jìn)行修正，從而得到較為客觀的指標(biāo)權(quán)重[2-4]。本試驗(yàn)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷以及固形物質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用G1-熵權(quán)法對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配，將主觀與客觀賦權(quán)相結(jié)合，優(yōu)選血脈疏通顆粒的最佳提取工藝，以提高試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性與嚴(yán)謹(jǐn)性，為后續(xù)該制劑的開(kāi)發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695-2998PDA 高效液相色譜儀、Em‐power?3 工作站（美國(guó)Waters 公司），Mettler-Toledo XS205DU電子分析天平［梅特勒托利多（中國(guó)）有限公司］，HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司），DHG-9035A 型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料

該復(fù)方所用中藥飲片購(gòu)于廣州眾力醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院李智勇主任中藥師鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2020年版一部各品種項(xiàng)下有關(guān)要求。

橙皮苷（批號(hào)110721-202019，純度95.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920-201505，純度97.1%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters Xbridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，15%B；15～25 min，15～22%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.2 mL/min。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含橙皮苷279.8 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷23.4 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱(chēng)取飲片195 g，提取2 次，每次加入8 倍量水，提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，濾液濃縮至250 mL。

精密量取濃縮液5 mL置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流4 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例稱(chēng)取除黃芪、陳皮外的8味飲片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 將上述對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入高效液相色譜儀，結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，陰性對(duì)照溶液色譜圖中橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷相應(yīng)位置無(wú)吸收峰，表明陰性無(wú)干擾，專(zhuān)屬性良好。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)HPLC圖Figure 1 HPLC chromatogram for specificity test

2.1.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取上述混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 至1 mL 量瓶中，加甲醇至刻度即制成每1 mL 分別含橙皮苷27.98、55.96、111.92、167.88、223.84 μg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.34、4.68、9.36、14.04、18.72 μg 的混合對(duì)照品溶液，再分別精密量取10 μL 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），得橙皮苷回歸方程為Y=3.93×102X-7.32×104，R=0.999 6，毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為Y=5.23×103X-4.64×103，R=0.999 7，說(shuō)明橙皮苷在279.8～2238.4 ng、毛蕊異黃酮葡萄糖苷在23.4～187.2 ng之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液（橙皮苷111.92 μg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷9.36 μg/mL），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積并計(jì)算RSD 值，結(jié)果顯示橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的RSD 值分別為0.24%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD 值。結(jié)果橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD 值分別為0.33%、0.28%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，再分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量RSD 值分別為1.45%、1.27%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已測(cè)定指標(biāo)成分含量的血脈疏通方濃縮液，精密量取6 份，每份2.5 mL，再精密加入橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量置具塞錐形瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率分別為98.52%、103.27%，RSD 分別為1.62%、1.85%，加樣回收率符合要求，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of sample recovery test（n=6）

2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)綜合賦權(quán)

2.2.1 G1 法主觀賦權(quán)[1-5]G1 法是對(duì)AHP 法進(jìn)行改進(jìn)的一種計(jì)算速度快、無(wú)需一致性檢驗(yàn)的主觀評(píng)價(jià)方法，首先確定評(píng)級(jí)指標(biāo)序的關(guān)系，記為y1>y2>…>ym；其次，確定相鄰指標(biāo)重要程度之比（rk），rk賦值見(jiàn)表2；確定了rk的理性賦值后，通過(guò)以下公式計(jì)算權(quán)重系數(shù)（wk）：

表2 rk賦值參考表Table 2 rk assignment reference table

式中：k=m，m-1……，2。

根據(jù)血脈疏通方君臣佐使的配伍原則，及有效成分的藥理作用，將3 個(gè)指標(biāo)關(guān)系設(shè)定為毛蕊異黃酮葡萄糖苷（y1）>橙皮苷（y2）>固形物質(zhì)量（y3），確定r2=1.3，r3=1.2，即毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度、橙皮苷質(zhì)量濃度、固形物質(zhì)量主觀權(quán)重系數(shù)分別為0.414 9、0.319 1、0.266 0。

2.2.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán)[5-10]熵是系統(tǒng)無(wú)序程度的度量，通過(guò)熵值來(lái)判斷指標(biāo)的變異程度，變異程度越大，則包含的信息量越多，其對(duì)應(yīng)的權(quán)重也應(yīng)該越高，具體步驟如下：

①建立原始矩陣。設(shè)m個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)、n個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象，形成原始數(shù)據(jù)矩陣（Xij）mn。Xij表示第i次實(shí)驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的取值。

②將原始矩陣轉(zhuǎn)換為概率矩陣（Pij）mn。

③計(jì)算指標(biāo)熵值（Hi）。

④計(jì)算指標(biāo)權(quán)重系數(shù)（Wi）。

計(jì)算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、固形物質(zhì)量客觀權(quán)重系數(shù)分別為0.256 3、0.553 8、0.189 9。

2.2.3 組合權(quán)重的確定（Wj） G1 法確定主觀權(quán)重為W1，熵權(quán)法確定的客觀權(quán)重為W2，計(jì)算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、固形物質(zhì)量組合權(quán)重系數(shù)分別為0.318 8、0.529 8、0.151 4。公式如下：

式中：Wj為第j個(gè)指標(biāo)的綜合權(quán)重；W1j為第j個(gè)指標(biāo)的主觀權(quán)重；W2j為第j個(gè)指標(biāo)的客觀權(quán)重；m為評(píng)價(jià)指標(biāo)個(gè)數(shù)。

2.3 血脈疏通顆粒提取工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、加水量（C）為主要考察因素，以橙皮苷質(zhì)量濃度和毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度及固形物質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)選血脈疏通顆粒的水提工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 因素與水平Table 3 Factors and levels

2.3.2 固形物質(zhì)量的測(cè)定 精密吸取各樣品濃縮液25 mL，置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照2020年版《中國(guó)藥典》四部“干燥失重測(cè)定法”測(cè)定，計(jì)算固形物質(zhì)量，公式如下：

固形物質(zhì)量=（W×V）/25，

式中：W為25 mL 濃縮液中干固形物質(zhì)量，V為定容體積。

2.3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 按處方比例稱(chēng)取飲片9份，每份195 g，按正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表對(duì)血脈疏通顆粒提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，提取液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣計(jì)算橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量及固形物質(zhì)量，結(jié)合“2.2.3”項(xiàng)下的組合權(quán)重，進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。由方差分析結(jié)果可知，影響提取效果的因素順序?yàn)樘崛〈螖?shù)>加水量>提取時(shí)間，其中提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P<0.05），確定最優(yōu)提取工藝為：A3B1C1，即提取3次，每次加6倍量水，提取1 h。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental design and results

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance results

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取飲片3份，按上述優(yōu)選工藝提取，再分別測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷含量及固形物質(zhì)量，結(jié)果顯示，3 批平行試驗(yàn)綜合評(píng)分平均值為99.25，RSD 為0.93%，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Validation test results

3 討論

血脈疏通顆粒對(duì)氣虛痰瘀型頸動(dòng)脈硬化及斑塊形成患者的臨床療效顯著，受到廣泛認(rèn)可，全方由黃芪、陳皮、黨參等10 味飲片組成。文獻(xiàn)研究顯示，本處方藥材同功能主治及現(xiàn)代藥理作用相關(guān)的主要有效成分主要存在于水提取液中，包括皂苷類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、氨基酸等[11-12]，結(jié)合本處方在臨床運(yùn)用中一直以湯劑入藥有效的現(xiàn)狀以及生產(chǎn)設(shè)備條件，確定提取工藝是全方采用水煎煮提取。

中藥復(fù)方制劑起效成分復(fù)雜多樣，采用多指標(biāo)優(yōu)化顯然更符合現(xiàn)代制劑的需求，考慮到毛蕊異黃酮葡萄糖苷是君藥黃芪的主要有效成分，可以通過(guò)調(diào)節(jié)NO/cav-1/MMPs 通路，保護(hù)腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的完整性[13-14]；橙皮苷作為臣藥陳皮的主要有效成分，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，從而抑制高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-1-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[15]；固形物質(zhì)量則直接影響到制劑的成型性能，也是藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本試驗(yàn)選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度、橙皮苷質(zhì)量濃度、固形物質(zhì)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，使優(yōu)選的提取工藝更符合中藥復(fù)方制劑多成分、多靶點(diǎn)的治療體系。

在多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)中，權(quán)重的確定極為重要，本試驗(yàn)采用G1-熵權(quán)法主客觀組合賦權(quán)，同時(shí)兼顧了試驗(yàn)者的主觀性與待評(píng)價(jià)對(duì)象的客觀內(nèi)在聯(lián)系，使得血脈疏通顆粒提取工藝多指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。