甘草附子湯對膝關節骨關節炎大鼠NF-κB信號通路的影響

趙杰，蘇啟表，李之琛，鄒瑜聰，劉曉欽，邱學軍，3

（1.廣東藥科大學健康學院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫科大學附屬第一醫院關節外科，廣東 廣州 510000；3.廣東省光與健康工程技術研究中心，廣東 廣州 510000）

膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關節軟骨的磨損退變并伴隨膝關節周圍骨贅增生的關節退行性疾病。隨著KOA的病理進展，患者膝關節將有不同程度的關節畸形、活動障礙、關節疼痛、肌肉萎縮等臨床表現，終末期KOA 嚴重影響患者的生活質量。臨床報道甘草附子湯（GCFZ）對KOA 具有一定療效，但其作用機制尚不明確[1-2]。本實驗探討GCFZ 對KOA 大鼠的作用及相關分子機制，為其應用于KOA的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠，體質量200～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2019-0035；動物飼養于SPF 實驗室，正式實驗前適應性飼養1周。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 中藥飲片炙甘草、淡附片、白術、桂枝均購自廣東康美藥業有限公司（批號分別為200108、200203、191020、191221）。木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸購自美國Sigma-Aldric 公司（批號分別為：19812TE、158K1284）；BCA 蛋白定量分析試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（貨號：P001S）；大鼠IL-6、TNF-α和IL-1βElisa 試劑盒購自深圳達科為生物技術有限公司（批號分別為：

372019121、392020019、152019113 ）；P65、IκBα、p-IκBα及β-actin 抗體購自美國CST 公司（貨號：9936）；IKKα/β和p-IKKα/β抗體購自英國ABCam公司（批號分別為：ab235402、ab244563）；逆轉錄試劑盒購自大連Takara 公司（批號：RR047A）；雙氯芬酸鈉購自廣東臺城制藥股份有限公司（批號：201908015）；引物由上海生工生物工程公司合成。Multiskan Sky 全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；37450 電子觸覺測試儀購自意大利Ugo Basile 公司；SDS 電泳系統、濕轉膜系統購自美國Bio-Rad 公司；FluorChem R 多功能成像分析系統購自美國Proteinsimple 公司；ABI7500 基因擴增儀購自美國Applied Biosystems 公司；600R 雙足平衡測痛儀購自美國IITC公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 GCFZ 制備方法如下：稱取炙甘草15 g、淡附片15 g、白術15 g、桂枝30 g，全方用10 倍量水浸泡30 min后煎煮30 min，反復煎煮2次，合并煎液，過濾減壓濃縮至含生藥質量濃度為1 g/mL 的溶液，置4 ℃冰箱保存，臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。木瓜蛋白酶混合液制備：在無菌條件下用生理鹽水將木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸分別配制成質量濃度為0.04 g/mL、0.03 mol/L 的溶液，置4 ℃冰箱保存，于實驗前將木瓜蛋白酶溶液與L-半胱氨酸溶液按體積比2∶1混勻，靜置10 min備用。陽性藥物雙氯芬酸鈉臨用前用生理鹽水稀釋至濃度為0.25 mg/mL的溶液備用。

1.2.2 動物分組、模型建立及給藥[3]采用隨機數字表法將大鼠分為空白組、模型組、陽性藥物組、GCFZ高劑量組和低劑量組，每組8只。模型建立方法：以造模當天計為第1 天，于第1、4、7 天，麻醉大鼠后將其仰臥位固定，空白組每只大鼠右側膝關節腔注射生理鹽水0.2 mL，其余4 組注射木瓜蛋白酶混合液0.2 mL。第2 天，空白組和模型組均給予生理鹽水；陽性藥物組給予雙氯芬酸鈉溶液，劑量為0.002 5 g/kg；GCFZ 高劑量組和低劑量組分別給予GCFZ 9.0 g/kg、4.5 g/kg，各組動物每天灌胃1 次，給藥容積均為10 mL/kg，連續灌胃至第28天。

1.2.3 大鼠膝關節寬度測定[4]在第1天造模前和第14、28 天采用電子游標卡尺測定大鼠膝關節寬度，觀察膝關節腫脹情況。

1.2.4 機械性痛閾測定[5]按照文獻采用電子觸覺測試儀測定大鼠機械刺激縮爪閾值（paw with‐drawal threshold，PWT），測定時間與“1.2.3”項相同。方法如下：將刺激針對準大鼠后爪足底并逐漸增加刺激壓力，大鼠感覺到痛覺瞬間出現縮足、舔腳等陽性反應時移開刺激針，記錄此時所給予刺激壓力的數值，每只大鼠重復測定3次，每次測定間隔時間為5 min，取其平均值為PWT。

1.2.5 雙足平衡法測痛實驗[6]將大鼠放入測痛儀測定通道中，使其前足立于通道隔板，兩側后足分別放置于兩側稱量踏板，待儀器檢測數值穩定后，按下開始鍵記錄此時雙側下肢的負重值，連續測量3 次，每次測定間隔時間為3 min，計算其平均值，按公式計算右下肢負重百分比。右下肢負重百分比=100×右下肢負重值/（右下肢負重值+左下肢負重值），測定時間與“1.2.3”項相同。

1.2.6 Elisa法檢測大鼠膝關節腔關節液TNF-α、IL-6和IL-1β水平[7]第28天灌胃4 h后，麻醉大鼠于右側膝關節腔穿刺取關節液，并用100 μL PBS 灌洗關節腔，收集灌洗液，3 500 r/min離心10 min，取上清液按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.7 RT-PCR方法檢測膝關節滑膜組織TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達情況[8]第28天處死動物后分離收集大鼠右側膝關節滑膜組織，稱取30 mg剪碎加入1 mL Trizol試劑，冰浴中迅速勻漿，按文獻［8］提取總RNA，用核酸蛋白儀檢測RNA濃度，取1 μg總RNA使用cDNA 第一鏈合成試劑盒對樣本逆轉錄合成cDNA，用Sybr Green RT-PCR Master Mix配置20 μL反應體系，置PCR儀進行PCR擴增，記錄PCR反應過程中的Ct值，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct計算TNFα、IL-6和IL-1βmRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.2.8 Western blot 方法檢測滑膜組織p65、IκBα、p-IκBα、IKKα/β、p-IKKα/β蛋白表達情況[8]第28天，處死動物后稱取30 mg 大鼠右側膝關節滑膜組織，提取組織總蛋白，采用BCA 法測蛋白濃度。取適量體積的蛋白樣品20μg 與去離子水和2×SDS 加樣染料混合均勻后，置蛋白變性儀97 ℃加熱5 min，使蛋白質變性，然后進行SDS-PAGE 電泳分離目標蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，70 min，隨后采用250 mA 恒流條件下轉膜90 min 將電泳分離后的蛋白轉移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST 洗滌5次，5 min/次，放入含相應一抗的稀釋液（一抗用5% BSA 溶液按1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，10 min/次，然后加入HRP 標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次，采用ECL化學發光法顯影檢測蛋白表達情況。

1.2.9 統計分析 采用軟件SPSS 25.0進行統計學處理，計量數據以表示，組間多重比較采用One-way ANOVA 分析，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett'sT3法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠膝關節寬度比較

第1天造模前，比較各組大鼠膝關節寬度，差異無統計學意義（P>0.05），組間具有可比性。第14、28 天，與空白組比較，模型組膝關節寬度顯著增加，腫脹明顯（P<0.01）；與模型組比較，3 個給藥組（陽性藥物組、GCFZ 高、低劑量組）膝關節寬度均顯著下降（P<0.01），抑制關節腫脹效果明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠膝關節寬度比較Figure 1 Comparison of knee joint width of rats in each group

2.2 各組大鼠機械性痛閾比較

造模前，比較各組大鼠PWT，差異無統計學意義（P>0.05）。第14、28 天，與空白組比較，模型組PWT 顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，3 個給藥組PWT均顯著提高（P<0.05，P<0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠機械性痛閾比較Figure 2 Comparison of mechanical pain threshold of rats in each group

2.3 各組大鼠右下肢負重能力比較

下肢負重力量分布的變化與疼痛行為相關。第1天，各組大鼠右下肢負重百分比約為50，組間差異無統計學意義（P>0.05）。第14，28 天，與空白組比較，模型組右下肢負重百分比顯著下降（P<0.01），表明注射木瓜蛋白酶混合液能誘導KOA 大鼠膝關節疼痛，導致雙下肢不對稱負重明顯；與模型組相比，3個給藥組均能提高右下肢負重能力（P<0.05，P<0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠右下肢負重能力比較Figure 3 Comparison of weight-bearing capacity of right lower limb of rats in each group

2.4 各組大鼠膝關節腔關節液炎性細胞因子水平比較

與空白組比較，模型組關節液TNF-α、IL-6和IL-1β濃度均顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，陽性藥物組和GCFZ 高劑量組能明顯降低TNF-α水平（P<0.05，P<0.01），GCFZ低劑量組有降低TNF-α水平的趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）；各給藥組均能降低IL-6和IL-1β水平（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膝關節腔關節液中炎性細胞因子水平比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory factors in the synovial fluid of knee joint of rats in each group(±s，n=8)ρ/(pg·mL-1)

表2 各組大鼠膝關節腔關節液中炎性細胞因子水平比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory factors in the synovial fluid of knee joint of rats in each group(±s，n=8)ρ/(pg·mL-1)

與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

IL-1β 14.95±3.54 79.02±9.79**54.55±9.71##65.02±5.10##66.22±5.55#組別空白組模型組陽性藥物組GCFZ高劑量組低劑量組劑量/（g·kg-1）--0.002 5 9.0 4.5 TNF-α 27.94±5.57 229.92±43.68**149.53±15.82##166.61±14.20#195.63±13.99 IL-6 10.77±2.35 31.31±4.09**16.93±3.71##22.89±3.52##23.79±2.62##

2.5 各組大鼠膝關節滑膜組織TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA表達的比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-6 和IL-1βmRNA 表達均顯著上調（P<0.01）；與模型組相比，3個給藥組能下調TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達（P<0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠膝關節滑膜組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達的比較Figure 4 Comparison of the expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β mRNA in knee joint synovial tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠膝關節滑膜組織NF-κB 信號通路相關蛋白表達的比較

如圖5A、5B 所示，與空白組比較，模型組大鼠膝關節滑膜組織NF-κB p65 蛋白表達升高，IκBα蛋白表達下降、蛋白降解明顯，磷酸化蛋白p-IκBα、p-IKKα/β表達增加。與模型組相比，3 個給藥組能明顯抑制p65 蛋白表達、抑制IκBα蛋白的降解和磷酸化，并能下調p-IKKα/β蛋白表達。各組對IKKα/β蛋白的表達沒有明顯差異。

圖5 各組大鼠膝關節滑膜組織NF-κB信號通路相關蛋白表達的比較Figure 5 Comparison of the expression of NF-κB signaling-related proteins in knee joint synovial tissue of rats in each group

3 討論

GCFZ 始載于張仲景的《傷寒論》，臨床報道有不少醫者應用此方或加味方治療KOA，可以有效緩解患者癥狀、改善膝關節功能，但其機制有待研究[1]。

本實驗首先采用木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸復制KOA大鼠模型，該模型操作簡便、動物生存率高，造模型4 周符合早期KOA 的癥狀表現，是一種較為成熟的造模方法[9-10]。如圖1－圖3所示，GCFZ能抑制KOA大鼠膝關節寬度增加、提高機械疼痛閾和右下肢負重能力，表明GCFZ 能夠緩解早期KOA 大鼠的膝關節腫脹、減輕疼痛，對KOA具有一定療效。

有研究表明KOA 是一種涉及持續性低度炎癥和炎癥通路激活的疾病，其發生和加重與炎性細胞因子有著密切聯系，關節囊滑膜組織和關節腔內TNF-α、白介素等細胞因子的過度分泌能促進軟骨降解、滑膜炎癥和軟骨下骨的吸收，加快關節軟骨退變的速度和炎癥的生成，使膝關節的功能活動發生障礙[11-13]。本實驗結果顯示，GCFZ 能降低KOA大鼠膝關節腔關節液TNF-α、IL-6 和IL-1β的濃度、下調膝關節滑膜組織3 種細胞因子mRNA 的表達，表明GCFZ能夠抑制膝關節TNF-α等炎性細胞因子的分泌。

NF-κB 在炎癥反應、免疫反應以及正常細胞和惡性細胞的存活中起著重要作用，關節炎、自身免疫性疾病等多種病變均存在NF-κB 通路功能失調的現象[14-15]。有研究表明KOA 患者滑膜組織中存在大量的NF-κB，NF-κB 的激活先于關節炎的臨床表現[16-17]。在哺乳動物中，NF-κB 是由多肽鏈p50 與p65 形成的同源/異源二聚體，該二聚體與IκB 蛋白結合形成三聚體復合物使其處于失活狀態。當受創傷、炎性因子的刺激時，細胞膜受體激活導致IκB 激酶（IκBkinases，IKKs）的磷酸化，進一步激活IκB發生磷酸化和泛素化，導致IκB 構象改變并被降解、三聚體復合物的p65和p50從而被釋放，NF-κB進入細胞核啟動和調控TNF-α、IL-1β等靶基因的表達[18-19]。已有研究表明，治療KOA 的部分藥物如阿司匹林、布洛芬等可以抑制IKKα/β活性，進而抑制IκB 磷酸化阻止NF-κB 通路的激活[21]。如圖5結果所示，GCFZ可以明顯抑制滑膜組織p65的表達，減少IκBα的降解、磷酸化以及IKKα/β的磷酸化，由此推斷GCFZ可能是通過介導NF-κB信號通路抑制KOA大鼠膝關節炎性細胞因子的分泌，改善膝關節癥狀。

綜上所述，GCFZ 能緩解KOA 大鼠的膝關節腫脹、減輕疼痛、抑制膝關節炎性細胞因子的分泌，其機制可能與調控NF-κB信號通路的激活有關。