右美托咪定對急性肺損傷小鼠NLRP3炎性小體介導炎癥反應的作用研究

何達，張莉

（榆林市第一醫院呼吸內科，陜西 榆林 719000）

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是一種嚴重的臨床并發癥，其病死率為30%～40%。ALI 通常以炎癥細胞聚集、血管和上皮通透性增加、間質水腫、氣體交換異常和肺泡間隔損傷為特征，但治療ALI 的有效藥物很少[1]。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌的一種成分，通常會導致炎癥反應和肺損傷[2]。LPS誘導的急性肺損傷是一種廣泛應用于ALI病理和藥物干預研究的動物模型，體內實驗表明鼻內注射LPS 可顯著增加炎癥細胞浸潤、氧化應激和細胞凋亡[3]。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種高度選擇性的α2-腎上腺素能受體激動劑，臨床上用于患者的鎮靜[4]。DEX 具有鎮靜和鎮痛作用，可通過抗炎和免疫調節作用預防LPS 誘導的急性肺損傷[5]。DEX 預處理可通過抑制受Toll 樣受體4（TLR-4）/核因子-κB（NF-κB）信號通路，調節細胞因子的產生來減輕敗血癥引起的急性肺損傷[6]。DEX通過下調高遷移率族box-1 蛋白（HMGB1）和晚期糖基化終末產物（RAGE）通路受體來減輕膿毒癥刺激的急性肺損傷。另外，在IL-17 誘導的急性肺損傷小鼠模型中，DEX 以劑量依賴性方式降低了IL-17 的炎癥作用，并通過降低連接蛋白-43 蛋白水平抑制間隙連接功能，顯著減少LPS 誘導的人肺成纖維細胞系凋亡。近期，有研究發現DEX 通過靶向miR‐381抑制NLRP3炎性小體活化[7]。但DEX是否以劑量依賴性抑制NLRP3 炎性小體活化介導的急性肺損傷尚不清楚，因此，本研究的主要目的是評價不同劑量的DEX 對LPS 誘導的急性肺損傷的保護作用，并探究是否與NLRP3炎性小體介導的炎癥反應有關。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

右美托咪定注射液購自江蘇恒瑞醫藥（國藥準字H20090248）；TNF-α（430907）、IL-1β（740865）、IL-6（431307）和MCP-1（446207）小鼠ELISA試劑盒購自BioLegend 生物公司（美國）；一抗NLRP3（15101）、ASC（67824）、Caspase-1 p20（24232）、IL-1βp17（12703）和β-Actin（4970）均購自CST 生物公司（美國）。

1.2 實驗動物

C57BL/6 小鼠（6～8 周）25 只，雄性，體質量20～25 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（陜）2020-001。

1.3 分組與給藥

將25只小鼠按照隨機數表法分為對照組、模型組、DEX 12.5 μg/kg（低劑量）組、DEX 25 μg/kg（中劑量）組和DEX 50 μg/kg（高劑量）組，每組5只。根據文獻[6]，鼻腔給予10 μg LPS[溶解于50 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）]誘發急性肺損傷。對照組和模型組均預先30 min腹腔注射生理鹽水，DEX 各組按照劑量預先30 min腹腔注射相應劑量的DEX。然后，除對照組外，各組均鼻腔給予LPS，對照組給予PBS。LPS 處理6 h 后，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，然后插入氣管插管，用0.4 mL預冷PBS沖洗肺部3次，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）以及肺組織。

1.4 BALF炎癥因子含量評價

以3 000g離心10 min，收集上清液于EP 管，并儲存于-80 ℃或直接檢測。使用ELISA試劑盒檢測小鼠BALF 中TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 的含量，于450 nm處測量吸光度（A），計算含量。

1.5 肺組織濕質量/干質量（wet-dry weight,W/D）值評價

用濾紙擦拭右肺中葉，并稱質量，即濕質量（W）。隨后，將肺組織放入烘箱中，在60 ℃下干燥48 h，然后再次稱重，即干質量。計算濕質量與干質量比值，即W/D值。

1.6 小鼠BALF總蛋白評價

采用BCA 法測定BALF 蛋白濃度，用于評價肺血管通透性。

1.7 BALF細胞計數

收集BALF，于4 ℃下以400g離心10 min，棄上清，1.0 mL PBS 重懸細胞。固定細胞并離心，加入瑞氏-吉姆薩（Wright-Giemsa）復合染色液評估細胞形態，對于每種細胞類型，采用光學顯微鏡檢查并計算數量。

1.8 病理評價

取右肺上葉組織，放入4%（φ）多聚甲醛中過夜固定，用自來水沖洗5 min，石蠟包埋，切片（5 μm），然后用蘇木精和伊紅（HE）染色。光學顯微鏡分析組織病理學。根據出血、肺泡充血、中性粒細胞浸潤和肺泡擴張對肺損傷的嚴重程度進行評分，5分評分系統：0：無；1：輕微；2：適中；3：嚴重；4：非常嚴重[8]。

1.9 蛋白印跡

稱量約50 mg 肺組織樣品，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液中裂解30 min。用BCA 蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離后，將40 mg 蛋白質電泳轉移到PVDF 膜上。將膜用封閉液（5%脫脂奶粉）封閉1 h，然后與特定的一抗（NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、IL-1βp17和β-Actin，按1∶1 000稀釋）在4 ℃下孵育過夜。第2 天，在用PBST 洗滌3 次后，將膜與HRP 耦聯的二抗（1∶10 000 稀釋）在室溫下再孵育1 h。最后，用增強型化學發光試劑盒顯影，并采用Image軟件灰度掃描。

1.10 統計學分析

所有計量數據均以表示，使用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計分析，采用單向方差分析（ANOVA）進行多組間統計學分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠BALF中炎癥因子含量比較

與對照組比較，模型組小鼠BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1含量顯著升高；相較于模型組，DEX 低、中、高劑量組小鼠BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1 含量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠BALF中炎癥因子含量比較Figure 1 Comparison of inflammatory factors in BALF of mice in each group

2.2 各組小鼠肺W/D值和BALF蛋白含量比較

與對照組比較，模型組小鼠肺W/D 值和BALF蛋白含量明顯升高；相較于模型組，DEX 低、中、高劑量組小鼠肺W/D 值和BALF 蛋白含量明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。

圖2 各組小鼠肺W/D值和BALF蛋白含量比較Figure 2 Comparison of lung W/D value and BALF protein content of mice in each group

2.3 各組小鼠BALF 中總細胞數、中性粒細胞和巨噬細胞數比較

與對照組比較，模型組小鼠BALF總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數顯著升高；相較于模型組，DEX 低、中、高劑量組小鼠BALF 總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞數顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見圖3。

圖3 各組小鼠BALF中總細胞數、中性粒細胞和巨噬細胞數量比較結果Figure 3 Comparison of the number of total cells，neutrophils and macrophages in BALF of mice in each group

2.4 各組小鼠肺組織病理HE染色比較

相較于對照組，模型組和低劑量組小鼠觀察到肺組織嚴重的炎癥反應（水腫、炎性細胞浸潤）；相較于模型組，DEX 中劑量組和高劑量組小鼠炎性細胞浸潤緩解，表現為肺泡壁厚度和病理評分降低，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織病理HE染色比較結果Figure 4 Comparison of HE staining results of lung tissue pathology of mice in each group

2.5 各組小鼠肺組織中NLRP3炎性小體表達比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 p20 和IL-1βp17 蛋白表達水平顯著升高；相較于模型組小鼠，DEX 低、中、高劑量組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 p20 和IL-1βp20 蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織中NLRP3炎性小體表達比較結果Figure 5 Comparison of the expression of NLRP3 inflammasome in lung tissues of mice in each group

3 討論

膿毒癥是ALI 的常見原因，約占所有ARDS 病例的25%[9]。LPS 誘導的ALI 具有多種病理生理學特征，并與相互關聯的炎癥級聯反應發展有關；促炎細胞因子在導致肺損傷的炎癥反應發生和發展過程中具有重要作用[10-11]。LPS 誘導的ALI 模型與肺中性粒細胞的積累和巨噬細胞的激活有關，促進炎癥細胞因子和細胞的釋放，增加肺泡-毛細血管通透性。本研究發現DEX 治療組小鼠BALF 中總細胞和中性粒細胞明顯降低，BALF 蛋白含量降低，這些結果說明DEX 能有效降低ALI 小鼠的肺泡-毛細血管通透性。同時，DEX 明顯降低了ALI 小鼠BALF 中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 含量，這些因子與炎性細胞浸潤肺部密切相關[12-13]。ALI 的病理特征表現為多形核中性粒細胞、纖維蛋白沉積物、肺泡出血和肺水腫液積聚相關的急性炎癥反應[14-15]。和預期的一樣，DEX 明顯緩解了ALI小鼠的肺部病理損傷，包括炎性細胞浸潤緩解，即肺泡壁厚度和病理評分降低。這些說明DEX 具有明顯的抗ALI 小鼠的肺部炎癥反應，并且給藥濃度為12.5 μg/kg 時，依然具有顯著的抗炎活性，包括緩解肺泡-血管通透性和炎癥因子產生。

據報道，DEX預處理可上調Cav-1的表達，降低髓過氧化物酶活性和炎癥細胞浸潤，緩解肺組織病理損傷，抑制炎癥反應以減輕LPS 誘導的ALI[16]。另外，DEX 能抑制ALI 小鼠肺組織TLR-4 和NF-κB的表達，并且DEX 通過抑制HMGB1 介導的TLR-4/NF-κB 和PI3K/Akt/mTOR 途徑從而緩解LPS 誘導的急性肺損傷[17]。除了抗炎反應外，DEX 通過抑制間隙連接蛋白和降低連接蛋白-43 的蛋白表達減少LPS 誘導的肺成纖維細胞凋亡，并維持肺泡-毛細血管的通透性[18]。DEX 也通過激活Nrf2/Keap1 信號通路和調節抗氧化基因的表達改善LPS 誘導的肺部炎癥和氧化應激[19]。上述文獻報道了DEX 的抗炎相關通路，但大多涉及TLR4 介導的信號途徑。近期有研究[20]發現DEX（25 μg/kg）通過靶向miR‐381 抑制ALI 小鼠肺組織中NLRP3 炎性小體活化，但DEX 是否呈劑量依賴性抑制ALI 小鼠NLRP3 炎性小體活化尚不清楚。本研究探討了不同劑量的DEX對NLRP3炎性小體活性的影響。

炎性小體是一類位于細胞質多蛋白復合物，在先天免疫中發揮重要作用，炎性小體控制促炎細胞因子的成熟和分泌，包括IL-1β、IL-18 和細胞焦亡。NLRP3 炎性小體由NOD 樣受體（NLRP3）、銜接蛋白ASC 和Caspase-1 組成，是一種重要的細胞內多蛋白炎癥復合體[21]。在各種刺激（微生物和應激物質等）下，NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1 組裝，形成聚合體，切割pro-Caspase-1 激活Caspase-1，并切割pro-IL-1β形成成熟的IL-1β[22]。之前研究發現DEX（25 μg/kg）能抑制ALI小鼠肺組織中NLRP3和Caspase-1 p20 的表達，并降低血清IL-1β水平[7]。本研究結果發現DEX 不僅能抑制ALI 小鼠肺組織中NLRP3 和Caspase-1 p20 表達，并降低ASC（炎性小體組裝的關鍵蛋白）和IL-1βp17（即成熟型IL-1β）表達。這些結果說明DEX 可能是通過抑制ALI 小鼠肺組織中NLRP3 炎性小體的活化而降低ALI 小鼠全身炎癥反應（即血清炎癥因子水平降低），并緩解組織損傷。

綜上所述，本研究發現DEX 對LPS 誘導的ALI小鼠具有保護作用，包括緩解肺損傷、肺水腫和炎癥反應，并呈劑量依賴性抑制NLRP3 炎性小體活化。但DEX 的抗炎作用涉及多種信號通路，包括TLR4 介導的信號等，這些信號之間是否密切相關或涉及其他信號調節仍不清楚。后續研究會進一步研究DEX抗ALI損傷的確切機制。