骨髓間充質干細胞治療骨科疾病研究進展

梁朝鑫,周安遠,王 偉,周 游,戈 超,高莉鵬, 李興勇,張 琨,雷 云,楊 淵

(1．廣西中醫藥大學，廣西 南寧530200；2．廣西醫科大學，廣西 南寧530021； 3．廣西骨傷醫院，廣西 南寧530012；4．廣西醫大開元埌東醫院，廣西 南寧530028)

骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有良好的多向分化和自我更新能力的多能干細胞。在1976年Friedenstein等[1]首次從骨髓中提取出BMSCs。由于其具有取材方便且易于分離培養、擴增等特點，使其在骨與軟組織治療方面起到了日益廣泛的作用。近年來，有關BMSCs的研究得到了擴展，特別在治療骨科疾病方面中的應用越來越廣泛，由于其發揮的臨床效果顯著，目前已用于多種骨科疾病的替代療法。本文結合近年國內外BMSCs的相關臨床研究，就BMSCs的分離與鑒定、生物特性，及其對骨缺損、股骨頭壞死、骨關節炎、脊髓損傷、修復關節軟骨和椎間盤等方面的研究進展進行綜述，旨在為臨床治療骨科疾病提供參考。

1 BMSCs的分離方法與鑒定

目前，對于BMSCs體外分離培養的方法主要有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、組織消化法等，每種方法都存在各自的優劣。迄今為止，常用的方法是密度梯度離心法[2]。密度梯度離心法是依據顆粒的不同密度和直徑引起的沉降速度的不同，在離心作用下各顆粒以一定的速度沉降，進而在不同的密度梯度區域上形成區帶的原理，分離出不同密度的細胞[3]。有研究顯示，密度梯度離心法能夠有效分離出BMSCs，并發現密度在1.067～1.070 g/ml之間的介質分離出的骨髓間充質干細胞明顯增多，因此在使用不同密度的介質進行分離具有重要意義[4]。此方法具有操作簡便、耗費低廉等的優勢，可在選擇合適的密度介質后進行分離更容易獲得較高純度BMSCs。

由于BMSCs缺乏特異性表面標志物，目前對于BMSCs的鑒定方法尚未得到統一，最常用的方法是使用流式細胞術對其進行鑒定。流式細胞術鑒定發現BMSCs對CD44、CD73、CD90表面標志物表達陽性，且陽性率均達到90%以上，而造血干細胞表面標志物CD34、CD45表達陰性[5]。流式細胞術具有靈敏度高、精度高、多參數等特點，因此應用在BMSCs鑒定方面得到了進一步推廣。

2 BMSCs的生物學特性

BMSCs可在自身中提取，取材方便且來源充足，由于其具有多向分化和自我增殖的特點，大量研究證明BMSCs有向成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞等方向分化的潛能。骨科疾病的治療中，BMSCs發揮出了自身的特性，給在臨床上骨與軟組織的修復帶來更佳的治療方式。BMSCs在骨與組織修復中的主要特性：①BMSCs具有強大的增殖能力和多向分化的特性：在適宜的體內或體外環境下，BMSCs有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、基質細胞等多種細胞分化的能力[6-7]。②BMSCs具有分泌多種內分泌因子的潛能：產生的內分泌因子參與到組織中的增殖、凋亡、免疫調節和血管生成等過程中，促進損傷區域的恢復，引起免疫系統的反應，從而起到保護其他細胞免于凋亡的作用[8]。

3 BMSCs在治療骨科疾病的應用

隨著近年來許多研究顯示出BMSCs的治療優勢，結合其獨特的生物學特性，越來越多的研究者將其運用到治療骨科疾病過程中。在基礎和臨床研究中運用BMSCs治療骨缺損、股骨頭壞死、骨關節炎、脊髓損傷及修復關節軟骨和椎間盤等方面獲得了廣泛重視，并廣泛運用在各種組織修復和再生醫學的臨床決策中。對此，國內外對使用BMSCs治療骨與軟組織損傷做了大量的研究。

3.1 治療骨缺損 由骨折或骨腫瘤切除等因素引起的骨缺損一直是創傷骨科面臨的重大難題，常使用自體骨移植或骨搬運術的方式治療。因為植骨術可用的骨量有限，而骨搬運術又需要很長的時間來治療，因此需要利用BMSCs分化為成骨細胞的能力，以達到治療骨缺損的目的[9]。研究顯示，BMSCs可以成功誘導新骨的形成，并且具有良好的安全性[10]。一項研究發現共同培養的BMSCs和內皮祖細胞不僅加速骨缺損的修復，還促進了支架上血管和骨骼的形成[11]。BMSCs可能顯著提高了骨誘導支架的骨再生能力[12]。Lawrence等[13]通過研究分析了各種支架材料的細胞整合、活力和獲得的BMSCs的分化能力對治療骨缺損療效，發現BMSCs對頭部組織和骨科再生醫學領域產生積極影響。Dina等在36只雙下肢脛骨缺損的大鼠中，各在左脛骨缺損接受富含血小板的纖維蛋白(PRF)，右脛骨接受加載在殼聚糖支架上的BMSCs，結果顯示BMSCs和PRF雖都能有效治愈大鼠脛骨模型中誘導的骨缺損，但BMSCs的愈合效果更佳，在所有時間點都表現出比PRF更高的平均鈣和磷重量百分比。一項隨機對照實驗將絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石(SF/CS/nHA)和BMSCs三維支架修復兔長節段性骨缺損，發現載有BMSCs的SF/CS/nHA支架在修復橈骨節段性缺損取得很好的治療效果，均優于其他治療組[14]。雖然擁有大量將BMSCs運用在治療骨缺損的基礎研究，并且大多取得良好的療效，但在臨床上運用BMSCs治療骨缺損的研究數量和研究樣本量仍需要進一步擴大，以更好的證實BMSCs的治療機制。

3.2 治療股骨頭壞死 股骨頭壞死是一種發病機制不明確、病因復雜的進行性疾病，常導致髖部疼痛和功能障礙，其發病的原因可分為創傷性與非創傷性，創傷性股骨頭壞死一般由于外力作用使傳送營養到股骨頭的血管遭到破壞，非創傷性股骨頭壞死常見大量使用激素或長期飲酒導致血液循環受阻而發病。一項將BMSCs和內皮祖細胞聯合移植治療類固醇誘導的兔股骨頭壞死的研究中顯示，3D支架中聯合移植BMSCs和內皮祖細胞促進了成骨和血管生成同時減少脂肪生成，達到修復股骨頭壞死的效果[15]。Mardones等[16]通過核心減壓和植入BMSCs治療股骨頭壞死，隨訪19～54個月后，發現所有患者的疼痛強度均明顯減輕，且髖關節功能得到明顯改善。一項臨床隨機對照研究，將100例患者隨機分配為BMSCs治療或核心減壓治療,術后60個月，53例接受BMSCs治療的髖關節中只有2例病情加重并接受血管化骨移植，而核心減壓治療除去失訪的7例患者，在治療的44個髖關節中出現了10個髖關節病情加重，后期均行血管化植骨或全髖關節置換術治療，證實了BMSCs在治療股骨頭壞死方面有效地延遲或避免了進行髖關節置換[17]。一項納入了14項研究，涉及540例患者的薈萃分析顯示，髓芯減壓聯合自體BMSCs具有更好的鎮痛作用和臨床療效，并可更有效地延緩股骨頭塌陷[18]。通過既往大量的基礎和臨床試驗使用BMSCs運用在治療股骨頭壞死的研究，又隨著近些年臨床治療數量的不斷增加和臨床上的可靠療效，值得相信BMSCs是治療股骨頭壞死的有效方法。但其在臨床的應用也面臨著諸多挑戰，如患者的選擇、標準化程序、安全性評估以及移植細胞的生長情況等[19]。所以未來仍需做進一步探索，尋找解決最適宜的移植方法、移植細胞數和細胞來源等問題，從而更好地在臨床上應用BMSCs治療股骨頭壞死。

3.3 治療骨關節炎 骨關節炎是一種隨著年齡的增長，患病率隨之增長的退行性疾病，可由創傷、遺傳、發育等因素誘發。研究[20]表明，關節內注射BMSCs明顯改善了患者的疼痛、功能和生活質量，可有效治療膝骨關節炎。一項臨床隨機對照研究，將30例膝骨性關節炎患者隨機分配，對照組予以關節內注射透明質酸，兩個治療組分別予以透明質酸與10×106或100×106培養的自體BMSCs,通過隨訪12個月發現使用BMSCs的治療組在VAS和WOMAC評分均優于對照組，驗證了關節內注射BMSCs是改善膝骨關節炎功能安全可行的方法[21]。Chahal等[22]發現BMSCs在治療膝骨關節炎同時可減少滑膜炎和軟骨退化的發生。雖然有諸多的研究支持BMSCs在治療膝骨關節炎的有效性，但對于注射的最佳方式與位置仍存在疑慮。對此，Hernigou等[23]將60例雙側膝骨關節炎患者予以左右膝分別在軟骨下骨或關節內注射BMSCs，通過兩年的隨訪發現對于軟骨下骨治療組的60個膝關節中有12(20%)例接受了關節置換術，而關節內治療組的60個膝關節中有42(70%)例選擇了關節置換術，表明了在膝關節軟骨下骨植入BMSCs的療效更好，且更有效地推遲關節置換術的發生。當前，BMSCs治療骨關節炎的研究，已從基礎實驗慢慢向臨床研究過渡，值得肯定的是其在治療膝骨關節炎發揮了良好的療效，但對于臨床上骨關節炎分期的治療、治療效果的持久性和不同體質的適應性等問題仍需進一步研究和思考。

3.4 治療脊髓損傷 脊髓損傷是一種發病率高、致死致殘率高的疾病。它可由挫傷、割傷、壓迫或直接的暴力破壞等創傷因素引起的，并且破壞了神經元通路[24]。目前，急性脊髓損傷的治療方式主要有藥物治療和手術減壓，隨著對BMSCs研究不斷深入，用于治療脊髓損傷的研究也日益增加。一項采用左T9脊髓半切術建立大鼠脊髓損傷模型的研究顯示，BMSCs與堿性成纖維細胞生長因子聯合移植可有效修復大鼠脊髓損傷[25]。Wang等[26]發現BMSCs可能通過調節抗氧化信號通路，進而過表達的miR-200a或si-Keap1的促進了大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復，同時降低丙二醛(MDA)水平，增加超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和核因子E-2-相關因子2(Nrf2)表達及其下游血紅素加氧酶1(HO-1)、NADPH醌氧化還原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)蛋白表達。研究[27]發現，BMSCs衍生的外泌體可通過激活自噬，減弱神經元凋亡，促進脊髓損傷的大鼠功能行為的恢復。Mo等[28]采用Allen沖擊器建立T10脊髓損傷模型中，實驗組和對照組分別在蛛網膜下腔以注射方式給予BMSCs和PBS，結果顯示實驗組Nestin和NeuN表達明顯升高，GFAP表達明顯降低，實驗組的神經營養因子水平高于對照組，表明了BMSCs可通過調節移植的細胞因子，提高神經細胞的存活和再生能力，并促進神經功能的恢復。對此，BMSCs促進脊髓損傷功能恢復的作用機制可能與其的神經營養、免疫抑制、代替功能和促進軸突再生有關[29]。因此認為BMSCs可改善脊髓損傷癥狀，促進神經功能的恢復。

3.5 修復關節軟骨與椎間盤 關節軟骨的損傷可導致關節疼痛、畸形和功能障礙，由于軟骨缺乏神經和血管，所以當軟骨損傷時自身的自愈能力非常有限。劉軍政等[30]發現高表達的miR-193b、miR-34a、miR-30a、miR-130b、miR-152、miR-99a、miR-90a和低表達的miR-424、miR-135共同參與了大鼠BMSCs軟骨分化的調節過程。而人體中的miRNA比大鼠要復雜，且相互之間也有相互調節的能力。研究[31]發現，BMSCs在體內植入時具有形成骨和軟骨組織的能力。Araki等[32]在18只獼猴的36個膝關節中造模成膝關節全層骨軟骨缺損，隨機分為不予藥物的干預空白組、僅植入膠原凝膠的凝膠組和植入含有BMSCs 的膠原凝膠的BMSCs組，24周后結果顯示，凝膠組雖顯示出大部分富含軟骨的修復組織覆蓋缺損，而BMSCs組盡管產生的新軟骨量較少，但軟骨表面規則且質量更好，與鄰近的軟骨無縫整合，并重建了軟骨下骨。一項使用源于BMSCs的三維無支架自體構建體植入兔膝關節的骨軟骨缺損處的研究，在1年內實現了骨和軟骨同步再生，同時證明了此方法具有修復骨和軟骨缺損的潛力[33]。由于BMCSs移植在修復關節軟骨缺損方面的有用性已在基礎研究的猴和兔的模型中得到證實，對此在臨床上也做了這方面的研究。在一項臨床研究[34]中通過同種異體的BMSCs與自體軟骨細胞的組合，以刺激組織的再生，并顯著改善了患者膝關節癥狀和軟骨缺損的狀態。Yong等[35]在一項含有80例接受軟骨修復手術和伴隨高位脛骨截骨術的患者的臨床研究中，比較了單獨植入BMSCs的MSC組和與同種異體軟骨一起植入BMSCs的MSC-AC組的效果，通過MSC組平均27.3個月和MSC-AC組平均27.8個月的最終隨訪顯示MSC-AC組在軟骨再生方面優于MSC 組，并具有更好的臨床效果。因此，對于BMSCs在修復軟骨方面的應用，可認為配合BMSCs的植入可能會取得更佳的療效。

椎間盤退變是一種常見的疾病。研究[36]發現，將自體BMSCs注射到髓核區具有可行性和安全性，并明顯緩解了疼痛和改善生活質量。BMSCs可以通過激活AKT和ERK信號來減弱內質網應激，且防止髓核細胞死亡并改善了椎間盤退變[37]。Pettine等[38]通過分析了大約1mlBMSCs的總有核細胞(TNC)含量、集落形成單位-成纖維細胞(CFU-F)頻率、分化潛能和表型特征發現雖然通過BMSCs治療后患者的癥狀均得到了不同程度的緩解，但接受超過2000 CFU-F/ml的患者的殘疾指數(ODI)和視覺模擬量表(VAS)降低速度更快，幅度更大。相對于自體BMSCs注射治療，Noriega等[39]將24 例診斷為腰椎間盤退變且對保守治療效果不佳的慢性背痛患者隨機分為兩組，實驗組在局麻下通過椎間盤內注射同種異體BMSCs，而對照組接受麻醉劑對椎旁肌肉組織的假浸潤，實驗組在BMSCs移植后3個月，VAS和ODI均顯著減輕，并在6個月和12個月時保持改善，且在所有時間點均優于對照組，進以證明了同種異體BMSCs可能是治療退行性椎間盤疾病的有效替代方法，并且比自體BMSCs治療更方便，具有可行性與安全性。不管是自體BMSCs還是同種異體BMSCs，在修復椎間盤退變中均顯示出積極的作用，可減輕患者的疼痛、降低殘疾率。

4 結 語

綜上所述，目前BMSCs在骨科領域的研究越來越受重視，但在臨床方面的應用仍相對較少。由于BMSCs獲取方便且安全性高，其具有的多向分化和分泌內分泌因子的潛能，使其在治療骨科疾病中取得顯著的療效，這為骨科醫生提供了一個良好的治療方案。但其在骨缺損、股骨頭壞死等方面的作用機制尚未明確，對移植的細胞數量和細胞來源的不同、載體的選擇等問題導致療效的不確定性仍未解決。雖然在基礎實驗中擁有大量的研究表明BMSCs對骨與軟組織損傷治療中發揮可靠的作用，但還需要在大型動物模型和臨床中進一步研究也需要更長的隨訪時間，對BMSCs的治療進行評估和優化以確定其的作用機制。隨著再生醫學的不斷發展，我們可以相信BMSCs未來能夠在骨與軟組織損傷疾病為人們提供更多的選擇和幫助，推動骨與軟組織損傷治療水平的發展。