廣西主要植煙區青枯病菌與黑脛病菌鑒定及混發情況初探

王五權，張得平，彭麗娟，孔 菲，孫成龍，桑維鈞，盧燕回，楊茂發

(1.中國煙草總公司 廣西壯族自治區公司，廣西 南寧 530022；2.貴州大學 煙草學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州中醫藥大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025)

煙草青枯病是由青枯勞爾氏菌(R.solanacearum)引起的一種土傳病害[1]。是一種高溫高濕型病害，溫度和濕度是病害發生和流行的先決條件。青枯病發病最適宜的溫度為30～35 °C。濕度是影響該病發病流行的另一重要因素，我國南方夏季溫度高、雨量多、濕度大，導致青枯病發展快，為害較重。煙草青枯病在苗期和大田期均可發病，作為典型的維管束病害，根、莖、葉均可受害，但以根、莖危害為主，煙株一旦染病常造成整株死亡，嚴重危害煙草生長和品質，造成產量和質量的毀滅性損失，嚴重阻礙煙草種植業的進一步發展[2-3]。

煙草黑脛病是世界煙草生產中危害最嚴重的病害之一，同時也是我國煙草主要土傳病害，其病原為煙草疫霉(P.nicotianae)[4]，該菌可為害煙草整個生育期，尤其是移栽后的大田煙株，侵染煙莖基部，發病初期在莖基部形成黑斑，條件適宜時，黑斑向上擴展，直至全株腐爛，病部布滿菌絲和孢子囊并傳染附近煙株。煙草黑脛病也屬高溫高濕型病害，最適發病溫度為24.5～32 °C，而且病株上產生的孢子囊和游動孢子借雨水或灌溉水、帶菌的土壤、糞肥傳播[5]。煙草黑脛病菌以卵孢子、厚垣孢子和菌絲體隨病株殘體在土壤中越冬[6]。該病在煙田易發生蔓延，破壞性極強，對煙草生產造成嚴重影響。

煙草黑脛病和青枯病均屬于高溫高濕病害，發病條件相近，故經常混合發生，危害十分嚴重，且難以防治，常對煙田造成毀滅性破壞，而且兩種病原菌有很強的越冬能力，一旦二者成功定殖煙田，會造成煙田多年無法種植煙草。廣西壯族自治區地處長江以南，屬亞熱帶季風氣候，氣候溫暖，雨量充沛，適宜煙草種植，成為全國最具發展種植優質煙葉潛力的產區之一[7]，得天獨厚的自然條件為生產優質煙葉提供了良好的氣候條件，但同時也利于煙草青枯病和黑脛病的發生及流行，烤煙是廣西的主要經濟作物之一，種植面積約1700 hm2，是農民脫貧致富的主要經濟來源，隨著煙田連作年限的延長，煙草青枯病和黑脛病近年來發生普遍，嚴重影響烤煙的產量和品質，已經是限制烤煙發展的重要障礙。本研究對廣西烤煙主產區病害進行調查，明確現階段引起廣西煙草主要病害的種類、分布以及危害程度，為掌握煙草病害的發生發展規律和制定合理有效的防治措施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試標本采集

2021年5～6月，于廣西賀州、百色及河池等3市主要煙區采集具有典型煙草青枯病、黑脛病癥狀的標本，具體地點見表1。每塊發病煙田至少采集3株病株。

1.2 試驗方法

1.2.1煙草青枯病菌分離和鑒定

分離方法：選取新鮮的發病植株，從莖部的病健結合處切取少量組織，先以滅菌水清洗2～3次，在超凈工作臺晾干磨碎后加入10 mL滅菌水。28 °C、200 r/min 培養30 min。分別采用組織分離法、病株根圍土壤樣品平板梯度稀釋法[8]和直接菌液稀釋法等3種方法分離煙草青枯菌，所用培養基為參照劉艷霞[9]的方法配制改良的牛肉膏蛋白胨培養基，該培養基加入多種抑制真菌和放線菌的抗生素以及TTC，因此只能分離出致病性細菌，且致病性越強，菌落顏色越深。

快速鑒定方法：分別將青枯病菌單菌落挑取到液體培養基中進行培養，30 ℃，220 rpm，培養3～4 h后進行多重菌落PCR。利用NCBI Primer-BLAST 在線設計16SrDNA、speI和rpsS基因的部分序列的保守區片段引物，為快速檢測，控制擴增片段長度在1000 bp以下，16SrDNA-f:ACTAACGAAGCA GAGATGCATTA，16SrDNA-r:CCCAGTCACGGCAG AGACT，speI-f:GTCGCCGTCAACTCACTTTCC，speI-r:GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG，rpsS-f:GATCG TCAAACCGATGAAGTC，rpsS-r:GATATGAC TCGTTCCGCAAAA。用高效擴增酶和快速擴增程序，擴增16SrDNA、speI和rpsS基因的部分序列，擴增結果經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行測序分析，結果在Genebank中進行序列比對。

1.2.2煙草黑脛病菌分離和鑒定

分離方法：參考鄭小波[10]的方法，選擇典型病株(圖1)切取煙株莖基部病健交界組織，剪成小塊，表面消毒后，置于燕麥培養基平板(參考方中達[11])上，28 ℃培養2～4 d后，根據菌絲形態進行分離純化并保存。

鑒定方法：純化后的煙草黑脛病菌，采用CTAB 法[12]提取總基因組DNA，PCR擴增部分ITS序列，擴增程序參考Pascual[13]的方法，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序，測序結果在Genebank中進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病、黑脛病混合發生情況初探

從廣西12個主產煙區采集煙草青枯病和黑脛病標本共116余份。結果發現，不同煙區煙草青枯病和黑脛病發生情況存在差異。河池市南丹縣六寨鎮采集標本2次，5月22日采集的標本發現煙草黑脛病與青枯病混合發生；6月13日未采集到煙草黑脛病與青枯病標本；河池市南丹縣八圩鄉采集的標本從外部癥狀上看為煙草青枯病，帶回實驗室縱剖感病煙株后發現部分為煙草黑脛病與青枯病混合發生。百色市隆林縣德峨鎮、蛇場鄉采集的標本均為煙草黑脛病，未采集到煙草青枯病標本。

表1 煙草青枯病、黑脛病標本采集時間地點

靖西市新甲鄉、地州鎮、魯利鎮和同德鄉等4個鄉鎮采集的標本有的僅發生煙草青枯病，有的煙草黑脛病和煙草青枯病混合發生。賀州市鐘山縣公安鎮，富川縣福利鎮和葛坡鎮采集的標本以煙草青枯病為主，有的煙草黑脛病和煙草青枯病混合發生。

從靖西市新甲鄉、地州鎮、魯利鎮和同德鄉等4個鄉鎮，隆林縣蛇場鄉和德峨鎮，南丹縣八圩鄉和六寨鎮，鐘山縣公安鎮，富川縣福利鎮和葛坡鎮等鄉鎮煙田采集的標本中隨機選取24株發病煙株觀察癥狀，從癥狀上判斷，煙草黑脛病和煙草青枯病混合發生的病株有13株(54.17%)，以靖西市新甲鄉、地州鎮和魯利鎮，鐘山縣公安鎮，富川縣福利鎮和葛坡鎮等地混合發生情況最為普遍(圖1)。

圖1 煙草青枯病與黑脛病混合發生的病株Fig.1 Tobacco bacterial wilt co-infection with black shank in Guangxi

2.2 煙草青枯病菌、黑脛病菌分離

從廣西12個主產煙區采集116份標本，分離到煙草青枯病菌103株，煙草黑脛病菌13株。

將青枯病發病煙株近根莖部橫切，切開后可見維管束已病變，顏色變為黑褐色、黑色。靜置10 min后，發病較輕的有少許白色或微黃色菌液溢出；發病嚴重的，表皮和木質部間溢出白色或微黃的菌液。青枯病菌在篩選培養基上，菌落為圓形，稍隆起，菌落中央呈紅色有光澤，周圍紅色稍淺，流動性較強，呈典型的青枯雷爾氏菌菌落形態(圖2-a)。

注：a為篩選培養基分離青枯菌；b為燕麥培養基分離黑脛病菌。圖2 煙草青枯病菌與黑脛病菌菌落形態Fig.2 Colony of R.solanacearum and P.nicotianae on media

縱剖黑脛病莖稈，可見髓部變為黑褐色，干縮呈碟片狀，碟片之間有白色菌絲。煙草黑脛病菌在燕麥培養基上氣生菌絲生長旺盛，呈白色絮狀，菌落質地均勻(圖2-b)。

2.3 煙草青枯病菌的鑒定

采用多重PCR技術對分離的青枯菌進行菌落PCR。結果表明：103株菌均可同時擴增得到大小分別為500 bp部分16S rDNA 序列、281 bpspeI基因的部分序列和180 bprpsS基因的部分序列的特異性擴增片段，將擴增的DNA片段切膠回收后測序，將測序結果在Genbank中比對，發現103株細菌均為青枯勞爾氏菌(R.solanacearum)。

2.4 煙草黑脛病菌的鑒定

顯微鏡下觀察黑脛病菌絲粗細不均勻，有菌絲膨大體，在膨大體上常有若干放射狀菌絲，厚垣孢子球形，頂生，孢子囊梨形(圖3-a)。將純化后的煙草黑脛病菌提取總DNA，PCR擴增部分ITS序列，進行瓊脂糖凝膠電泳(圖3-b)，將PCR產物測序后，結果在Genebank中進行序列比對，結果表明，測序菌株均為煙草疫霉(P.nicotianae)。

注：a為煙草疫霉厚垣孢子和孢子囊; b為部分煙草黑脛病菌ITS片段凝膠電泳結果。圖3 煙草黑脛病菌鑒定Fig.3 Identification of tobacco P.nicotiana

3 結論與討論

田間采集帶回的標本，將煙株根莖部橫切后，分為3種類型：以青枯病癥狀為主，以黑脛病癥狀為主，青枯病與黑脛病混合發生為主。煙草青枯病和黑脛病均為煙草土傳性病害，病株根莖相交處都可呈黑色壞死癥狀，田間常見兩種病害混合侵染。煙苗移栽期因外力扯拉易造成煙草根系損傷，病田殘留病菌易侵染煙苗，如先感染其中一種病害，都可能導致容易感染其他病害并加重為害[14-15]。

廣西煙區夏季高溫多雨的氣候條件適合生產優質煙葉，同時也適宜青枯病和黑脛病的發生與流行，容易造成大面積發病。通過調查，基本掌握了廣西主要植煙區煙草青枯病與黑脛病發生為害情況，隆林縣蛇場鄉和德峨鎮以煙草黑脛病為主，南丹縣六寨鎮與八圩鄉煙草青枯病與黑脛病混合發生，但較靖西市、富川縣和鐘山縣發病輕，其他煙區煙草黑脛病和青枯病均存在普遍復合侵染現象。不同縣之間煙田發病有一定差異，導致這些差異的原因除了不同地區的生態條件和環境因素外，煙田不同的耕作和管理模式差異也是重要原因。研究表明[16-19]，土壤中微生物種類間的競爭和繁殖是影響煙草青枯菌危害程度的重要因素。作者認為，科學的耕作方式與合理施用農藥在一定程度上可減輕兩種病害的大面積發生，針對廣西特殊的氣候條件和栽培管理模式，還可采用病原菌早期快速檢測、培育抗病品種和研制新型農藥等措施。

結合煙田病害調查與實驗室分離鑒定結果發現，在廣西主要植煙區青枯病與黑脛病混合發生較普遍。兩種病害均可破壞維管束組織，從而導致烤煙水分和營養物質輸送功能受損，進一步破壞煙葉的品質和產量。病害防治藥劑如不能有效輸送至發病部位，或藥劑使用不當易造成藥害或病原的抗藥性，而且多年烤煙連作使得感病程度加劇，對煙草青枯病和黑脛病的預防和治理帶來較大困難。因此，生產中可考慮同時或先后施用防治煙草青枯病與黑脛病的藥劑，減輕這兩種病害的危害。

生物防治通過與病原菌競爭營養和空間位點、分泌抑菌物質、誘發植物抗病潛能等直接或間接地抑制或殺死病原菌。因此，探索和研發生防產品對煙草根莖類病害的防治顯得尤為重要。目前已經有報道鏈霉菌能夠應用于煙草黑脛病的生物防治[20]，通過盆栽試驗證實枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能夠用于煙草青枯病的生物防治[21]，在煙草種植過程中，由于只能在移栽期前將生防菌施用大田，因而實行提前防治才能使得生防菌成功定殖，占領生態位、分泌抑菌物質或代謝產物。

對于廣西主要煙草種植區，早診斷和早鑒定在青枯病防治中很重要。將PCR技術應用于青枯病診斷及病原菌鑒定等方面國內外已有報道。而本研究先利用改良后的篩選培養基篩選煙草青枯菌，將活化后的菌液作為擴增的模板，再利用多個保守特異性片段引物進行多重PCR技術進行進一步鑒定，既簡化試驗步驟縮短檢測時間，又可減少土壤中其他微生物干擾。本研究中無論是青枯病發生較重的煙桿，還是發病初期的煙株，均通過這種方法成功分離到煙草青枯菌。因此，選擇性培養基和多重菌落PCR技術的聯合使用是一種檢測青枯病菌的有效方法，為鑒定煙草青枯病菌株提供了一種快速特異的檢測手段。