C-erbB-2在不同劑量丹參注射液聯合潑尼松龍治療OSF前后的表達變化研究

張國富，楊 帆，鄭 玥，肖雙霜

（湖北三峽職業技術學院附屬醫院口腔科，湖北 宜昌 443000）

近年來，人們對口腔疾病的重視度越來越高，但由于人們進食的食物存在多樣化，且攝入的高鹽、高脂及煎炸食物較多，因此導致口腔疾病的發病率逐年升高，尤其是年輕人的患病率更高。口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF）是一種慢性口腔疾病，可侵犯口腔的任何部位。在患病早期，患者可能表現為無癥狀，隨著病情的發展會出現口腔內燒灼感，尤其在進食刺激性食物時表現更為明顯，后期可出現吞咽困難、口腔黏膜變白、出現纖維條索等表現[1]。OSF 屬于口腔癌癌前病變，病因復雜，其發生與多種癌基因相互作用有關。本研究擬通過對OSF 組織進行檢測，觀察C-erbB-2 在各組標本中表達的差異性來探討運用丹參注射液聯合潑尼松龍治療OSF 的精確劑量，以達到最佳的臨床效果。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

隨機選取2019 年3 月至2021 年5 月間在我院口腔科、宜昌市中心醫院口腔科，宜昌市第一人民醫院口腔科進行治療的69 例OSF 患者作為研究對象，其治療方案均為丹參注射液聯合潑尼松龍，根據用藥劑量的不同將其分為小劑量組（A 組）、中劑量組（B 組）、高劑量組（C 組），每組各23 例。隨機選取同時期我院收治的10 例口腔黏膜正常患者作為對照。病例納入標準：OSF 患者的病情經臨床檢查得到確診；入組前未接受過相關治療；病理資料齊全；自愿參與本研究。在69 例OSF 患者中，有男性36 例，女性33 例；其年齡為26 ～67 歲。在10 例口腔黏膜正常患者中，有男性5 例，女性5 例；其年齡為22 ～56 歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 C-erbB-2 單克隆抗體（克隆系CBll）及SP 試劑盒，均購自上海博英生物有限公司；二步法檢測試劑盒、即用型SABC 試劑盒、酶底物DAB 顯色劑，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 檢測方法 免疫組化二步法（S-P）：取新鮮的口腔黏膜組織（包括OSF 組織與正常口腔黏膜組織），使用甲醛進行固定，甲醛濃度為4%。固定后用石蠟包埋，然后制備成5 μm 的切片，并對切片進行免疫組化染色，具體步驟：1）對制備好的載玻片進行去污處理，即使用濃硫酸重鉻酸鉀洗液浸泡。浸泡24 h 后進行防脫片處理，即浸泡在多聚賴氨酸稀釋液中24 h。處理后放在干燥箱中烘烤50 min。2）使用烤片機對載玻片進行烘烤，烘烤溫度為60℃，烘烤時間為4 h。3）置入100% 的二甲苯、95% 和80% 的酒精內進行脫蠟、水化處理。4）置入雙氧水（3%）中浸泡10 min 后，使用PBS 緩沖液進行沖洗，每次沖洗時間均為3 min，連續沖洗3 次。5）進行抗原熱修復：將載玻片浸泡于盛有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中進行加熱，保持水沸騰狀態2 min，之后放置于室溫下進行冷卻。6）添加一抗，工作液為p53 和Bcl-2，在冰箱內孵育過夜，冰箱內溫度為4℃恒溫，然后使用PBS緩沖液連續沖洗3 次，每次沖洗時間均為5 min。7）添加試劑1，在室溫下孵育20 min，再使用PBS 緩沖液沖洗3 次，每次沖洗時間均為3 min。8）添加試劑2，在室溫下進行孵育，時間為30 min，再次使用PBS緩沖液沖洗3 次，每次沖洗時間均為3 min。9）進行DAB 顯色：在室溫環境下進行反應，經鏡下控制反應時間，最后以自來水沖洗結束反應。10）使用蘇木素復染，使細胞核著色、脫水，最后應用透明、中性樹脂封片。

1.2.3 結果判讀 C-erbB-2 蛋白大部分表達于細胞漿內，顏色為棕黃色顆粒。在高倍鏡下對檢測結果進行判讀，具體判讀方法參考Campo 等[2]制定的標準：0 分：基本不著色；1 分：弱著色；2 分：中度著色；3 分：強著色。陽性細胞數所占比例共計分為四個評分等級：0 分：0% ～5% ；1 分：6% ～25% ；2 分：26% ～50% ；3 分：50% 以上。最后判讀結果= 陽性細胞所占比例+染色強度分值，0 分：陰性（-）；1 分：弱陽性（+）；2 分：弱陽性（+）；3 分：中等陽性（++）；4 分：中等陽性（++）；5 分及以上：強陽性（+++）。

1.3 觀察指標

觀察C-erbB-2 蛋白在OSF 組織與正常口腔黏膜組織中的表達情況。

1.4 統計學處理

采用SPSS20.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以均數± 標準差（±s） 表示，組間比較采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

C-erbB-2 蛋白大部分表達于細胞漿內，顏色為棕黃色顆粒。C-erbB-2 蛋白陽性細胞主要分布在口腔黏膜組織的上皮基底層；在OSF 組織中的表達為治療劑量越大，其增加程度越小；治療劑量越小，其增加程度越大。C-erbB-2 蛋白在正常口腔黏膜組織及C 組、B 組、A 組口腔黏膜組織中的陽性細胞數呈逐漸增加的趨勢，且分布范圍為逐漸從上皮基底層向表層擴散。見圖1。正常口腔黏膜組織中細胞周期蛋白依賴性激酶2 關聯蛋白1（CDK2AP1）的平均陽性率為（1.24±2.72）%，OSF 治療組上皮細胞平均陽性率：A 組：（26.71±8.93）% ；B 組：（22.41±5.91）% ；C 組：（18.24±6.43）%，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 C-erbB-2 蛋白在正常口腔黏膜組織及C 組、B 組、A 組口腔黏膜組織中的分布情況

表1 各組細胞C-erbB-2 蛋白的陽性率（%）

3 討論

C-erbB-2 是一種細胞來源癌基因，臨床上對其進行的研究主要集中于基因蛋白產物（P185）的過度表達和擴增方面[3]。研究發現，C-erbB-2 基因的產物是一種細胞膜受體，該蛋白與表皮生長因子受體（EGFR）有高度的同源性，與未知配體結合后，經蛋白激酶活性的刺激，可進一步促進細胞的分裂、增殖和轉化。C-erbB-2 的擴增或表達一般見于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌和肺癌等組織中，這證明其參與了某些癌癥的發生及發展[4]。正常狀態下，C-erbB-2均為未激活狀態，但當機體受到相關因素影響并出現變化后，其可能被激活，并出現向腫瘤轉化的活性。C-erbB-2 的激活過程主要是通過基因擴增來實現的，該基因擴增和腫瘤的發生有一定的關系[5]。研究認為，C-erbB-2 蛋白產物的免疫組化染色結果與基因擴增拷貝數之間呈明顯的正相關，因此，通過檢測口腔黏膜鱗癌組織中C-erbB-2 蛋白的表達情況，就可以對癌基因的擴增情況進行預測[6]。在Raha 等[7]研究指出，乳腺癌患者的C-erbB-2 蛋白呈高表達狀態，且在轉移的腋窩淋巴結中也呈高表達狀態。Hung 等[8]研究發現，鼠原癌基因C-erbB-2 在擴增狀態下，會導致起轉膜區點突變，最后激活了C-erbB-2，因此可認為C-erbB-2 癌基因是通過以上步驟激活的，即擴增和點突變激活。本次研究中，通過對正常口腔黏膜組織中C-erbB-2 的表達情況，以及不同劑量丹參注射液聯合潑尼松龍治療OSF 前后C-erbB-2 的表達情況進行分析，發現正常口腔黏膜組織中細胞CDK2AP1的平均陽性率為（1.24±2.72）%，OSF 治療組上皮細 胞 平 均 陽 性 率：A 組：（26.71±8.93）%；B 組：（22.41±5.91）%； C 組：（18.24±6.43）%。說明C-erbB-2在OSF 組織中的表達明顯高于在正常口腔黏膜組織中的表達（P＜0.05）。C-erbB-2 在OSF 患者口腔黏膜組織中的表達情況為：A 組＞B 組＞C 組（P＜0.05）。提示C-erbB-2 在口腔黏膜組織中的表達與病理組織學分級有關，組織分化程度越低，C-erbB-2 的陽性表達越高，因此可以初步判斷C-erbB-2 與口腔的惡性病變程度有相關性。臨床上應用丹參注射液聯合潑尼松龍治療OSF 的效果較為明顯，且在一定范圍內，用藥劑量越大患者的臨床效果越顯著。

綜上所述，C-erbB-2 在口腔黏膜中的表達水平會隨著口腔病變惡性程度的增高而增高，該指標對于運用精確劑量丹參注射液聯合潑尼松龍治療OSF 以及研究口腔病變惡性程度有一定意義。