基于JNK通路研究改良型富血小板纖維蛋白與β-三磷酸鈣復合物誘導成骨的機制

付冬梅，王 浪，周 婧，王 勁，楊 昕，李素蘭，蘭 紅

（資陽市雁江區人民醫院口腔科，四川 資陽 641300）

骨缺損的傳統治療方法有骨水泥+ 螺釘技術、自體骨移植、同種異體骨移植等，但均存在愈合速度慢、療效差等缺點，因此近年來發展迅速的骨組織工程開始應用于骨缺損的修復治療中[1]。雖然在骨缺損處植入骨組織材料對骨缺損的修復具有促進作用，但大部分骨代替材料只有引導成骨作用，材料成本昂貴，且存在免疫反應和疾病傳播的風險[2]。本團隊前期研究發現，利用血液濃聚物中提取的生物材料進行改良富血小板纖維蛋（A-PRF）被證實可促進軟硬組織的愈合及再生，與β- 三磷酸鈣（β-TCP）結合為復合物后能有效應用于口腔頜面外科、整形外科、運動醫學、牙周病學等多個領域[3]。作為改良型復合物，A-PRF 與β-TCP 復合物在誘導成骨方面已被證實效果比普通PRF 更佳，但詳細機制尚未明確。有研究發現，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNK）通路對骨分化與骨形成有促進作用，也能誘導骨形成蛋白（BMPs）的合成，促進成骨。目前發現骨形成蛋白2（BMP-2）可通過干預JNKs 而增加調控成骨的關鍵轉錄因子Osx 的表達，而骨形成蛋白9（BMP-9）是目前已知的BMPs 誘導成骨中最強的因子，BMP-9 具有促進干細胞體內外成骨的作用[4-5]。因此我們猜測A-PRF 與β-TCP 復合物可能通過調節JNK 通路產生誘導成骨的作用。為此，本研究基于JNK 通路研究A-PRF 與β-TCP 復合物對兔股骨缺損區域的誘導成骨效果，為臨床治療骨缺損提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性新西蘭大白兔24 只，5 ～6 月齡，體重（3±0.5）kg，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（川）2020-030，使用許可證號：SYXK（川）2019-189。

1.2 試劑

A-PRF 由資陽市雁江區人民醫院提供；β-TCP購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；兔堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）Elisa 試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；BMP-9、JNK、p-JNK抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.3 儀器

Multiskan Sky 酶 標 儀、CX33 顯 微 鏡（ 日 本Olympus 公司）、電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 主要實驗方法

1.4.1 構建兔股骨缺損模型與給藥處理[6]將動物分為模型組、1:1 復合物組（A-PRF:β-TCP=1:1）、2:1 復合物組（A-PRF:β-TCP=2:1）與4:1 復合物組（A-PRF:β-TCP=4:1）四組，每組各6 只。各組動物均靜脈注射3% 戊巴比妥鈉溶液（1 mL/kg）進行麻醉，在后肢膝關節外側距前緣1.0cm 處做一弧形切口，長度約為5cm。暴露股骨外側髁后，用骨鉆制備直徑為6 mm、深約8 mm 的圓柱形骨缺損區域，同時在距離骨缺損中央約6 mm 處，左右對稱旋入1 枚直徑為2 mm的鈦釘進行定位。復合物組在骨缺損區域填充0.5 mL復合物，模型組不進行填充。各組動物均使用醫用膠原修復膜覆蓋切口處，之后每天肌內注射80 萬U 青霉素鈉進行抗感染治療，持續3d。8 周后處死動物采集指標進行后續檢測。

1.4.2 大致觀察 術后觀察各組動物切口愈合的狀況，有無感染發生及飲食、活動狀況；術后8 周肉眼觀察骨缺損處的修復效果。

1.4.3 病理學檢測 采集各組動物股骨缺損區域組織，用4% 多聚甲醛固定24 h，脫鈣、脫水后制成石蠟切片，采用蘇木精- 伊紅（HE）染色法對切片進行染色，觀察骨缺損區域的愈合情況與新生血管的形成情況。

1.4.4 酶聯免疫吸附（Elisa） 檢測采集各組動物血液，分離血清，按照免疫酶聯試劑盒說明書對樣本進行檢測操作，檢測兔血清中ALP 和OCN 的含量。

1.4.5 蛋白質免疫印跡（WesternBlot） 檢測將收集的各組動物股骨組織置于液氮中研磨，進行蛋白質提取與定量，依次進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影處理，最后使用凝膠成像系統對條帶進行分析，計算蛋白質的表達水平。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同比例的APRF 與β-TCP 復合物對兔股骨缺損的修復效果

肉眼觀察發現，模型組股骨缺損處修復尚未完全，2:1 復合物組缺損區域基本恢復，效果最佳，其次為4:1 復合物組與1:1 復合物組。HE 染色發現，模型組骨組織損傷區域明顯，纖維組織增生情況嚴重，細胞核呈長梭形，炎性細胞浸潤數量多，新生毛細血管形成數量少；1:1 復合物組骨組織損傷區域明顯，植入材料分布明顯，組織與材料之間出現少量纖維組織，炎性細胞浸潤數量較多，淋巴細胞和中性粒細胞少量聚集，新生毛細血管形成數量少；2:1 復合物組骨組織之間損傷區域基本消失，可見少量植入材料分布，材料與骨組織之間出現較多纖維組織，炎性細胞浸潤數量較少，大多數為淋巴細胞，同時可見大量新生毛細血管形成；4:1 復合物組骨組織之間損傷區域較少，可見少量植入材料分布，材料與骨組織之間出現纖維組織，可見炎性細胞浸潤，新生毛細血管形成數量較多。結果見圖1。

圖1 四組動物股骨缺損區域修復情況與病理學觀察結果（HE 染色）

2.2 不同比例的APRF 與β-TCP 復合物對兔血清OCN 與ALP 的影響

Elisa 檢測結果顯示，與模型組相比，復合物組血清中ALP 與OCN 的含量均顯著升高（P＜0.05），復合物比例為2:1 時升高幅度最大。結果見表1。

表1 四組動物血清中ALP 與OCN 含量的變化情況（± s）

表1 四組動物血清中ALP 與OCN 含量的變化情況（± s）

注：* 與模型組相比，P ＜0.05 ；** 與模型組相比，P ＜0.01。

組別 ALP OCN模型組（n=6） 28.43±2.88 10.46±0.81 1:1 復合物組（n=6） 47.83±5.58** 14.45±1.83**2:1 復合物組（n=6） 70.25±3.04** 21.55±2.99**4:1 復合物組（n=6） 61.93±2.55** 19.58±2.11**

2.3 不同比例的APRF 與β-TCP 復合物對兔新生骨組織中JNK 通路的影響

WesternBlot 檢測結果顯示，與模型組相比，復合物組新生骨組織中BMP-9 與p-JNK 蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05），其中2:1 復合物組BMP-9、p-JNK 蛋白表達水平變化最大，JNK 蛋白表達水平則無明顯變化。結果見表2。

表2 四組動物新生骨組織中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表達情況（± s）

表2 四組動物新生骨組織中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表達情況（± s）

注：* 與模型組相比，P ＜0.05 ；** 與模型組相比，P ＜0.01。

組別 BMP-9 JNK p-JNK模型組（n=6） 1.000±0.012 1.000±0.059 1.000±0.020 1:1 復合物組（n=6） 1.375±0.068** 1.008±0.028** 1.409±0.066**2:1 復合物組（n=6） 1.934±0.106** 0.982±0.028** 2.488±0.047**4:1 復合物組（n=6） 1.563±0.044** 0.936±0.016** 1.775±0.029**

3 討論

生物復合材料介導的骨再生技術是一種很有前景的骨再生治療策略。我們的前期研究發現，A-PRF 與β-TCP 在促成骨中可發揮重要作用，但A-PRF 與β-TCP 復合物促進骨形成的潛在機制尚不清楚。本實驗通過建立兔股骨缺損模型發現，A-PRF 與β-TCP復合物能通過激活JNK 通路、誘導BMP-9 蛋白表達，產生骨修復作用，當A-PRF 與β-TCP 構成比例為2:1 時誘導效果最明顯。ALP 是常見的成骨分化標志物[7]，通過成骨細胞分泌，促進鈣、磷沉積在骨骼中，其含量的高低可反映成骨細胞的成骨能力[8]。OCN 是成骨分化過程中最敏感的指標之一，一方面可以提高ALP 的活性并加速與之結合，促進成骨細胞的增殖與骨形成；另一方面，OCN 與鈣離子結合對促進骨沉積和骨生長有積極作用[9]。有研究發現，OCN 的活性與成骨細胞分化和破骨細胞凋亡呈正相關[10-11]。因此，OCN 的高表達可增加骨基質，增強骨質。本研究發現，在骨缺損區域填充A-PRF 與β-TCP 復合物8 周后，新生骨組織中的ALP 與OCN 含量均顯著上升，復合物比例為2:1 時效果最好，說明在該比例下的A-PRF 與β-TCP 復合物誘導骨形成的效果最佳。MAPK 家族主要有三個亞家族，即細胞外信號調節激酶（ERK）、JNK 和p38。多項研究表明JNK 信號通路在調控成骨分化中發揮關鍵作用，JNK 磷酸化參與了成骨過程，大麻素受體通過激活JNK 通路可增強牙周韌帶干細胞的骨/ 牙本質分化能力[12]，褐藻多糖通過激活JNK 通路可誘導人間充質干細胞成骨分化[13]。在JNK 參與成骨分化的調控因素中，BMPs 的作用是至關重要的，BMP-9 被認為是最具成骨能力的BMP，比BMP-2 表現出更多的骨再生潛能。自BMP-9 被發現以來，因其比其他BMP 家族成員具有更高的促進骨形成的能力而受到廣泛關注[14-15]。有研究通過比較發現，與其他BMP 相比，BMP-9 能更有效地增強ALP活性，誘導滑膜間充質干細胞成骨分化，導致ALP、Runt 相關轉錄因子2（Runx2）、OCN、骨橋蛋白（OPN）mRNA 和蛋白的表達水平升高[16]。本研究發現，A-PRF與β-TCP 復合物能誘導新生骨組織中顯著增加JNK蛋白磷酸化水平，激活JNK 通路，從而增加BMP-9蛋白的表達，誘導成骨分化與骨形成。

綜上所述，本研究證實A-PRF 與β-TCP 組成的復合物可通過激活JNK 信號通路促進股骨缺損區域成骨，這可能是該復合物促進成骨的機制之一，且構成比例為2:1 時效果最佳。但由于JNK 通路與BMP-9蛋白刺激的骨形成涉及許多信號通路，因此A-PRF與β-TCP 復合物在骨再生技術中所起的骨形成作用機制還有待于進一步研究與發掘。