納米仿生技術在動脈粥樣硬化中的應用研究進展

楊詠琪,李洪亮,梁景巖

(揚州大學 轉化醫學研究院,江蘇 揚州,225001)

動脈粥樣硬化(AS)是心血管疾病的主要危險因素，然而他汀類藥物治療往往會對健康組織產生副作用，支架置入后也會產生再狹窄、炎癥、血栓等[1]。動脈搭橋手術易引起并發癥且康復時間較長[2]。納米技術在靶向性、免疫原性、生物相容性等方面體現出顯著優勢，同時生物體的特有功能與納米技術密切相關，于是開啟了從宏觀設計向微觀分子排列跨越的納米仿生技術大門[3]。本研究從生物膜涂層、蛋白載體、仿生人造血管、仿生納米機器人4個方面闡述納米仿生技術在AS中的研究進展，現報告如下。

1 生物膜涂層

細胞膜或類細胞膜涂層技術近年來備受研究者關注，其沒有傳統修飾的冗雜過程且可循環運用，細胞膜涂層的納米仿生顆粒是由內層納米顆粒核和外層生物膜殼組成的核殼結構[4]。不同細胞膜表面含有特定蛋白質、多聚糖、脂質層等，這賦予了納米顆粒多樣化的生物功能和廣泛化的應用范圍。目前廣泛運用于AS靶向治療的細胞膜來源有紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板、干細胞等，2種及以上的雜交膜可同時具備逃避免疫清除、延長機體內循環時間和提高靶向性等多重功能，執行更為復雜的任務。

1.1 RBC膜

RBC是血液中數量最多的細胞，于血液中壽命可達120 d。因此,RBC涂層技術所需的細胞膜來源豐富且于體內循環時間長。研究[5]表明，包裹了RBC膜的納米顆粒循環半衰期可長約40 h,機制在于RBC膜表面的CD47與免疫受體SIRP-α可互相識別從而抑制巨噬細胞對RBC的吞噬作用。2019年WANG Y等[6]首次嘗試將RBC膜包裹在納米藥物雷帕霉素 (RAP)@聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)上，對動脈粥樣硬化性心血管疾病動物模型進行治療。此納米仿生療法靶向AS病變部位的藥物聚集量是一般納米藥物的2倍，治療效果是普通納米藥物的3倍，裸藥的6倍。鐘元[7]用RBC膜包裹的RBC@多西他賽(DTX)/靶向多肽(CR8)可主動靶向炎性內皮細胞，經過1個月的治療后，小鼠主動脈斑塊面積減少至3.5%,壞死區域減小，易損斑塊穩定性提高且長期服用沒有任何毒副作用。紅細胞膜的“偽裝”降低了血液中免疫細胞對納米藥物的吞噬作用，增加了斑塊區域納米藥物的累積，實現了用藥的精準、有效、安全。

1.2 炎癥細胞和免疫細胞膜

AS是一種炎癥性疾病，大量的炎癥細胞被募集參與其發生發展過程。鑒于此,WU G H等[8]利用WBC膜包裹超順磁性良好的磁性納米簇(MNCs),然后依次嵌入抗炎藥物辛伐他汀(ST)和修飾靶向性載脂蛋白A-I模擬肽L-4F(AP)。由于WBC膜表面有CD45、CD3z等免疫標記分子，制備的MNC@M-ST/AP可逃避免疫蛋白的吸附，在AS早期靶向移行內膜泡沫細胞，遞送藥物減輕炎癥和氧化應激，有顯著的抗AS作用。

中性粒細胞在白細胞中占比最高。腦缺血時，由于炎癥細胞因子對中性粒細胞具有趨向性，中性粒細胞不受血流影響就可穿過血腦屏障(BBB)浸潤腦缺血損傷區，與病變細胞進行物質交換。同時搭配與中性粒細胞高效率結合的納米藥物，可治療如腦缺血等炎癥性中樞神經系統疾病[9]。這種基于炎癥因子自主引導藥物遞送的思路，對于運用中性粒細胞膜涂層技術干預AS炎癥反應具有重要意義。

巨噬細胞膜上高表達的整合素α4β1可以和血管內皮黏附因子-1(VCAM-1)特異性結合。鑒于此,WANG Y等[10]將巨噬細胞膜包裹在納米藥物上，構建了納米仿生藥物巨噬細胞膜/雷帕霉素納米粒MM/RAPNPs。該納米仿生藥物通過抑制巨噬細胞和平滑肌細胞的增殖從而安全有效地抑制了AS發展，同時生物相容性良好的特性可使其成為慢性血管疾病的長期治療藥物。與此同時,GAO C等[11]首次將巨噬細胞膜包裹的活性氧(ROS)響應性仿生納米制劑和吞噬藥物載體的活細胞制劑針對AS療效進行了對比。結果表明仿生納米制劑可在避免被網狀內皮系統清除的同時，吸附斑塊中的炎癥因子抑制炎癥級聯反應。然而，吞噬藥物載體的巨噬細胞制劑在斑塊炎癥環境中會啟動促炎機制，抗炎效果不佳。這對于后續選擇有效治療AS的合適劑型給予了指導。

1.3 血小板膜

血小板貫穿整個AS發生發展過程。當血管內皮功能發生障礙時，血小板隨即被激活，靶向黏附在血管損傷處，緊接著募集炎癥細胞于此，后期斑塊破裂不斷放大血小板的聚集效應，最終引發血栓導致梗死。運用血小板膜涂層技術或者將膠原受體[12]、糖蛋白受體和vWF受體修飾納米顆粒，均可使納米顆粒靶向聚集于損傷血管壁，同時搭載藥物可減緩AS發展進程和支架后的促內皮化。此外，還可將磁共振造影劑修飾在血小板膜包裹的納米顆粒表面，給藥1h即可形成顯著陽性對比增強效應，觀察到主動脈弓處縱向弛豫時間(T1)顯影，有利于實時追蹤AS的動態變化[13]。

1.4 干細胞膜

干細胞區別于其他細胞，擁有無限自我更新與定向分化的獨特能力，多用于血管疾病的內源性靶向修復。如TANG J N等[14]利用干細胞膜包裹載有干細胞分泌因子的納米顆粒，研究證明在心肌梗死后，該人工細胞模擬微粒能直接與心臟組織結合并促其生長，靶向修復了AS所致的心肌損傷。此外，臨床試驗證明間充質干細胞通過免疫調節可抑制神經炎癥反應，同時釋放生長因子和營養因子內源性修復受損的神經細胞，患者神經功能得到恢復，這為運用干細胞膜涂層技術治療中樞神經系統疾病提供了可能[15]。

1.5 外泌體

外泌體是一種可由多種活細胞分泌的直徑為40～150 nm的雙層膜結構囊泡，參與傳遞細胞間的通訊信息，同時內部可包裹納米顆粒或來自類同源細胞的遺傳物質、脂質、蛋白質等生物分子。低免疫原性、高靶向性、低毒性以及可穿越血腦屏障(BBB)等使其成為熱點生物標記物和納米藥物載體[16]。

近年來，外泌體作為AS等血管疾病的潛在治療工具受到廣泛研究，可通過調節內皮功能、血管平滑肌增殖分化、血小板與巨噬細胞的活化、血管鈣化等影響AS發展進程。為降低人力和時間成本，越來越多的研究旨在開發一種采用自上而下、自下而上或生物雜交策略的人工外泌體。已有研究團隊制備出一種天然與合成材料相結合的“半人工模擬外泌體”，在結構和功能上精確模仿天然外泌體的同時，產量將近500倍[17]。

此基礎上將不同細胞分泌的外泌體封裝納米顆粒，可構建成外泌體-納米仿生遞藥系統。如采用電穿孔技術[18]將戊氨基酮戊酸己酯鹽酸鹽(HAL)載入M2型巨噬細胞衍生的外泌體(M2 Exo)中,M2 Exo表面的趨化因子受體和抗炎因子體現出了良好的炎癥區域靶向性和抗炎性，包裹的HAL經過代謝和生物合成可產生一氧化碳和膽紅素，進一步加強了抗炎作用，有利于緩解AS發展進程。同時，內源性代謝生成的中間體原卟啉IX(PpIX)可用于AS的熒光成像。因此，外泌體-納米仿生遞藥系統拓寬了從外泌體角度診治AS的思路。

2 蛋白載體

目前，具有穩定性、良好生物相容性、制備簡易性等優勢的蛋白類納米仿生材料被用于合成醫學影像造影劑和納米載體藥物，實現深層組織的檢測診斷和靶向治療。成像方面，以蛋白為生物模板，利用仿生生物礦化原理，制備出的納米仿生無機復合材料較傳統造影劑對比度顯著增強;治療方面，鑒于仿生核殼結構自組裝的以蛋白為載體的納米顆粒，可躲避免疫系統的吞噬。應用于診療AS的主要蛋白種類有脂蛋白與白蛋白，尤其是高密度脂蛋白(HDL)和牛血清白蛋白(BSA)較廣泛。

2.1 重組高密度脂蛋白(rHDL)

直徑5～12 nm的小顆粒HDL可自由進出動脈管壁，通過經典的逆向轉運膽固醇途徑能消退斑塊達到抗AS的作用，同時還具有抗氧化、抗炎及激活一氧化氮合酶等生物學功能[19]。但HDL制劑僅來源于成本高昂的血漿,rHDL與HDL組分相似，模仿了人類內源性高密度脂蛋白生物學功能，可轉運疏水藥物且生物相容性良好、體內循環時間長、易大規模生產，是一個理想化的載藥體[20]。

然而，人類遺傳學和隨機臨床試驗[21]表明，單純性地升高血液中的HDL不能起到抗動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的作用且阻礙血管再生。約占70%HDL蛋白成分的載脂蛋白A-I(ApoA-I)同樣保留了促膽固醇逆向轉運(RCT)和抗AS等生物學功能[22]。rHDL可基于 ApoA-Ⅰ α螺旋和重組ApoA-Ⅰ研發。其中，基于 ApoA-Ⅰα螺旋研發的模擬肽如5A、6F以及雙螺旋復合物ETC-642，具有促進膽固醇外排、抗炎和抑制斑塊形成的顯著作用[23-24]。基于重組ApoA-Ⅰ研發的ApoA-Ⅰ Milano同樣具有穩定斑塊的作用，但由此研發的復合物ETC-216在臨床試驗中產生了嚴重的免疫刺激副作用。DUIVENVOORDEN R 等[25]將造影劑釓和近紅外染料共標記的圓盤狀他汀類重組高密度脂蛋白(S-rHDL)靜脈注射APOE-/-小鼠模型，血管壁的核磁信號和紅外成像表明該納米仿生顆粒主動靶向聚集于主動脈斑塊區域且直接作用于巨噬細胞，同時包裹的藥物他汀得以充分發揮抗炎作用。結果表明，無論是短期高劑量還是長期低劑量注射S-rHDL,均具有良好的AS診療效果。

2.2 白蛋白自組裝

由于白蛋白水溶性和載藥率高、無毒性且體內循環時間長，近年來興起了多種基于牛血清白蛋白(BSA)的自組裝納米仿生材料。同時研究[26]表明，血清白蛋白具有抗炎、抗氧化和抗凝血等生物功能，血清白蛋白水平與缺血性心臟病、血栓、腦卒中等動脈粥樣硬化性疾病有關。李祥[27]從分子層面設計了2種基于BSA的自組裝納米仿生材料，首先構建以BSA為載體的光聲分子探針BSA-Cy-Mito,這種探針提高了監測氧化應激、炎癥過程和斑塊穩定性的特異性、靈敏性，其次合成一種由巨噬細胞膜包裹的白蛋白姜黃素納米仿生藥物(MC-BSA-Cur),該藥物靶向聚集于易損斑塊處，具有顯著抗炎、抗氧化作用。因此,BSA憑借生物相容性好、包裹能力強、水溶性高、易吸收等特點可在分子水平上合成造影劑、納米藥物，實現對活體組織深部斑塊的精準診療。

3 仿生人造血管(支架)

AS后期，老化和破損的血管急需移植替換，然而異體血管移植會產生排斥反應，自體移植存在血管長度、大小不適配問題。模擬天然血管結構和功能的仿生人工血管不僅形狀可控、血液相容性高、長期安全有效，解決了不足4 mm小直徑人造血管帶來的血流速慢、剪切力弱、血壓低等問題，還可用于模擬建立體內血管模型研究血管結構、信號轉導、新藥測試等[28]。目前，制備仿生人造血管的常用方法有靜電紡絲技術和3D生物打印技術。

3.1 靜電紡絲技術

運用靜電紡絲技術制備的人造血管纖維達到了納米級，多孔且表面積高，有利于細胞的黏附、增殖和組織的長入，同時具有良好的力學和機械性能。鑒于此種技術,LIU K 等[29]制備了由PLA/PCL/PU 3層納米纖維構成的仿生人造血管，內層有利于內皮細胞的黏附;中層表現出了良好的機械性能;外層有利于平滑肌的排列，保證了良好的生物相容性和力學性能。在靜電紡絲技術的基礎上,CHENG S等[30]同時使用微流控技術模擬血管中的排布結構，在纖維納米薄膜材料上種植內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞3種細胞，最終將二維的薄膜卷成含有細胞聚集體的三維人造血管，通過對兔子模型的血管移植觀察，該仿生人造血管對于機體無任何排斥反應且具有同樣良好的力學性能。因此，靜電紡絲技術實現了移植物和天然血管的精準匹配。

3.2 3D生物打印技術

納米3D打印技術近年來廣泛運用于生物醫學的各個領域。較傳統打印技術,3D生物打印技術的材料環保且幾乎對細胞無害。血管打印方面,3D生物打印技術采用連續纖維復合材料且同時包含了細胞、生長因子、生物材料支架三要素，從而精準地仿造天然血管分級結構和功能。仿生人造血管可用于構建血管疾病模型，對復雜動脈瘤進行深層次的結構與治療研究，或者移植入體內[31]。然而材料高昂、打印速度慢及生物相容性差等一直以來都是生物組織工程在仿生人造血管中的難點[32]。ZHU W等[33]將醫學影像技術和計算機控制固化技術相結合，打印出來的人造血管血液循環正常、材料價格低廉且打印速度快，是一次突破性進步。隨即而來的4D打印技術，模仿自然界生物含羞草的應激形變原理，利用3D打印受到水、溫度或磁場等刺激時結構或性能改變的原理，制造出可隨復雜的內環境變化而相應變化的“活”的天然組織。

4 仿生納米機器人

仿生納米機器人是將納米技術與分子生物學相結合，參與細胞生命總過程的可編程分子機器人。仿生納米機器人具有養護血管的作用，當易降解的納米機器人植入體內后，巡邏到阻塞血液流動的血栓，可在光源、磁場、超聲波等驅動下精確地靶向遞送抗血小板、抗凝、擴張血管等藥物，提前修復即將破裂的血管[34]。研究團隊將L-精氨酸(LA)、β-珊瑚精和銅納米顆粒(Au NPs)三者共價結合，同時表面包被VCAM-1抗體，制備出一種一氧化氮(NO)和近紅外光(NIR)雙驅動納米馬達機器人，當納米機器人受到NIR照射時，通過Au NPs的光熱轉化，既能消融促炎巨噬細胞，又可被驅動聚集到斑塊區域[35]。LA與斑塊中活性氧(ROS)生成的NO不僅能修復內皮和降低氧化應激水平，還能提供額外驅動力。同時，β-珊瑚精溶解膽固醇從而有效減少斑塊的脂質沉積。研究結果表明，該機器人能夠有效抗AS，為新型納米機器人的制備和AS的非藥物性治療提供新思路。加利福尼亞大學團隊制備出一種人工材料硅制框架與天然鼠心肌細胞組成的納米機器人復合物，長出的肌肉通過吸收溶液中的葡萄糖自主收縮與舒張從而帶動硅制框架向前移動，可推開動脈中的脂肪沉積物從而恢復血管正常血流速度，這為研制納米機器人的動力系統提供了思路[36]。此外，仿生納米機器人還可通過修復受損細胞或者割補、編輯相應基因達到同樣的AS治療效果。

5 總結與展望

納米仿生技術在生物膜涂層、蛋白載體、仿生人造血管、仿生納米機器人等方面的研究對于AS的預防、診斷和治療有著重要意義，未來在動脈粥樣硬化中的研究將逐漸增加且多樣，但應用到臨床上仍面臨著諸多問題。其次，部分細胞供應不充足，細胞膜提取技術復雜及過程中膜蛋白易變性或被污染，且膜上的部分蛋白作用并不能代表整體膜蛋白作用機制。再者，模擬肽、仿生人造血管、納米機器人等成本高昂，今后需增強不同學科間的合作與交流，應用更多靶標人群能承擔得起的材料。