絲素蛋白在組織工程修復的研究進展

施心雨，李艾元，李 誠，宣智宏，岳萬福

（浙江農林大學動物科技學院、動物醫學院，浙江杭州 311300）

組織工程（tissue engineering）屬再生醫學領域，是結合多學科的原理研發出組織或器官的替代物，可應用于保持、替代、修復、加強病變組織、器官[1]。隨著醫學技術的發展，組織工程技術領域的出現和發展可彌補難以自主修復機體較大損傷的能力，使人類看到了“再生”的希望。近年來，組織工程為各類組織修復、再生領域不斷提供新方向，天然高分子生物材料在組織工程中表現出巨大應用的潛力而得到了國內外大量研究。

絲素蛋白（silk fibroin）作為一種天然大分子，在皮膚、神經、骨[2]等組織工程中作為生物材料展現出巨大的應用潛力。絲素蛋白是一種蛋白質聚合物，在形成不同的材料時具有良好的力學性能、生物相容性和生物降解性、低免疫原性等固有優點[3-4]。同時，絲素蛋白還具有較強的自組裝性能，無須化學交聯即可加工制成薄膜、水凝膠、顆粒、多孔海綿、三維多孔支架等多種形式的生物材料[5-6]，通過不同改性方法可形成生物支架、高強度水凝膠、藥物緩釋傳遞載體等多種形式的復合材料。本文介紹了絲素蛋白的結構、性能，重點討論總結了絲素蛋白在皮膚愈合、神經連接、血管再生、人造骨骼及人工軟組織等領域的最新進展，并對其在組織修復領域的挑戰及未來發展方向進行了展望。

1 絲素蛋白的結構和性能

1.1 絲素蛋白的結構

絲素蛋白是一種天然大分子蛋白材料，擁有排列整齊、高度保守的疏水基和結構復雜的親水基，為其提供了靈活性和穩健性[2-3]。絲素蛋白內含有18種氨基酸，其中11種為人體必需氨基酸。因此，通過蛋白酶的作用，機體內的絲素蛋白可降解成多肽被細胞代謝，無毒副作用[7]。絲素蛋白具有結晶區和非結晶區的混合結構，使分子鏈整體帶負電，對細胞具有一定的吸附作用，具有較好的細胞相容性[8]。絲素蛋白分子由重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈），通過P25蛋白的二硫鍵連接而成[9-10]。重鏈包括疏水性和親水性塊，疏水塊能夠形成反向平行的β-折疊二級結構[11]，使絲素蛋白具有特殊的機械性能。

1.2 絲素蛋白的性能

絲素蛋白具有獨特的結構和性能，如其具有優秀的力學性能、生物相容性、生物降解性能、緩釋性等。絲素蛋白具有高強度、高韌性、高柔韌性和高壓縮性等力學性能。優秀的力學性能及其在強度、模量、韌性、延展性、重量輕和柔韌性之間的平衡很可能是由絲素蛋白的納米纖維組裝方式所致[12]。在絲素蛋白膜上接種鼠L-929細胞，其生長速度與在膠原上的生長速度相當。在絲素蛋白纖維上接種多種細胞均能夠迅速附著并生長，表明了絲素蛋白與細胞的高度相容性。

絲素蛋白的生物降解性主要通過蛋白水解降解，降解程度與絲素蛋白的結構、形態特征以及酶的種類有關。根據降解需要，可利用絲素蛋白植入、力學環境以及形態、濃度等控制降解時間[13]。絲素蛋白內的SilkⅡ結構含量會可明顯地影響材料的降解速率，SilkⅡ含量越低，絲素蛋白降解速度越快。

2 絲素蛋白在組織工程修復領域的應用

2.1 皮膚創面修復

皮膚創面愈合是機體最復雜的過程之一，涉及多種細胞類型的空間和時間同步，包括止血、炎癥、生長、再生皮化和重塑[14]。受傷后，多個生物通路立即被激活并同步反應。皮膚創面修復過程通常會導致大塊組織纖維化，即瘢痕。要做到皮膚創面無痕化修復，需要借助生物支架、皮膚敷料等工具輔助傷口無痕化愈合。絲素蛋白對創面愈合的修復具有較大的優勢，無細胞毒性、生物相容性好、利于細胞生長，可為創面提供較理想的愈合條件，利于皮膚創面修復。

Liang等[15]設計了甲基丙烯酰化改性絲素蛋白（SilMA）以研究絲素蛋白水凝膠支架對皮膚細胞再生的機制，采用單細胞RNA測序的方法揭示了不同生物材料對創傷部位的細胞機制，有助于了解絲素蛋白水凝膠介導的皮膚再生機制。試驗測試了SilMA水凝膠對大鼠全層皮膚缺損模型的皮膚修復效果，結果顯示，與對照組相比，蠶絲蛋白水凝膠支架能夠募集更多促再生巨噬細胞和毛囊干細胞；SilMA水凝膠在傷口部位誘導了一個更利于皮膚傷口修復的細胞群結構，能夠更顯著地抑制皮膚瘢痕的形成并加快傷口愈合，有助于無瘢痕的皮膚再生。

Guo等[16]利用絲素蛋白濃縮自凝結的水凝膠溶液與絲素蛋白溶液混合，在-7℃環境下，利用電場作用調整材料的力學性能，構建了具有血管化功能的絲素蛋白支架，為快速創面修復提供了更多可能性；試驗通過凍結溫度和排列結構對絲素蛋白支架進行力學調整和物理結構調整，制備出5.9 kPa力學性能定向的絲素蛋白支架；通過絲素蛋白支架體外細胞相容試驗、體外血管化能力試驗以及大鼠全皮層創面缺損模型等體內、外試驗證明，該絲素蛋白支架具有明顯的血管化促進作用，并能夠加快創面修復速度。同時，該絲素蛋白支架具有促進干細胞向內皮細胞分化的能力并表現出良好的血管生成能力，可促進新血管生成。對創面修復而言，血管化是一個非常重要的影響因素，血管化越快，傷口愈合速度越快。

Qian等[17]在SF中加入金屬鎵（Ga3+），使SF帶負電荷的氨基酸殘基物理交聯，得到單交聯網絡；利用血紅蛋白（Hb）作為催化劑，構建雙交聯的SF網絡，其中Hb作為模擬過氧化物酶催化SF酪氨酸基團的交聯。此雙交聯的SF混合水凝膠可在傷口原位迅速凝膠化。試驗采用標準平板計數法測定水凝膠的體外抗菌作用，DCFH-DA探針檢測水凝膠培養的細菌產生的活性氧（ROS）證明補氧性，并通過細胞試驗驗證水凝膠的細胞相容性。試驗結果表明，該混合水凝膠具有良好的生物活性；小鼠全皮層創面缺損模型試驗表明，水凝膠敷料能夠加速組織修復中免疫調節、新血管形成和膠原蛋白重塑，細菌感染的糖尿病創面在15 d內完全愈合。體內、體外試驗證實，雙交聯混合水凝膠具有優異的力學性能以及蛋白酶響應釋放、抗菌活性、增強細胞增殖和防止缺氧的能力，同時可加速啟動傷口愈合的3個階段，成功觸發感染糖尿病創面在體內有效、完全地修復。

Wang等[18]利用自組裝肽NapFFSV-VYGLR觸發絲素蛋白凝膠化，通過非共價相互作用組成一種新的生物活性水凝膠（SV-SF）。該水凝膠具有良好的凝膠穩定性，同時還具有較高的誘導內皮細胞附著、生長和遷移的能力，能夠在結構和功能上模擬自然細胞環境，提供支架模擬血管生成因子蛋白的生物功能，促進血管形成。將該水凝膠植入小鼠皮膚缺損區后，對皮膚傷口進行HE切片、Masson染色以及免疫熒光染色等檢測，結果顯示，水凝膠能夠刺激膠原沉積和血管生成相關基因表達，促進血管生成和表皮化，加速表皮修復。合成的新型SV-SF水凝膠具有合成簡單、成本低、生物活性高、免疫應答風險低等優點，為促進血管生成提供了另一種途徑。

2.2 神經修復

成年哺乳動物的中樞神經系統損傷后形成的膠質瘢痕會導致神經再生阻滯，利用絲素蛋白的水凝膠、三維支架、導管等不同形態促進損傷后神經組織、血管、細胞外基質再生，有助于神經網絡的重建以及腦功能恢復。

Sultan等[19]通過混合溶劑高溫溶等工藝解凍干制得水溶絲素蛋白，將其與甲基丙烯酸明膠GelMA混合制得增強型水凝膠。通過基因改造骨髓基質細胞（BMSC）使其具備分泌腦源性神經營養因子（BDNF）的能力，利用GelMA/絲素蛋白復合水凝膠包埋BDNF-BMSC細胞；結果發現，絲素蛋白可誘導BDNF-BMSC細胞持續產生更多BDNF誘導神經細胞突觸伸展，促進神經修復。研究表明，隨著絲素蛋白含量增加，細胞分泌BDNF的量明顯提升。將神經細胞與該復合水凝膠共培養，結果顯示，含有更多絲素蛋白的組能夠誘導BDNF-BMSC細胞分泌更多BDNF且神經細胞的神經突觸可伸展更長。

Jiang等[20]通過設計制作一種具有腔體的三維膠原-絲素水凝膠支架3D-CF模擬正常脊髓的解剖結構，利用3D支架，使細胞在體內和體外生長，可觀察神經干細胞NSCs與3D-CF聯合移植對脊髓損傷修復的影響。結果顯示，除假手術組外，3D-CF+NSCs組的神經功能評分明顯高于其他組；運動誘發電位測試中，3D-CF+NSCs組潛伏期明顯降低，振幅明顯升高；磁共振成像和彌散張量成像結果顯示，3D-CF+NSCs組脊髓連續性和損傷腔填充效果最好，表明3D-CF聯合NSCs植入可促進損傷脊髓的修復。3DCF可填補損傷空洞，促進神經纖維再生，抑制膠質瘢痕的形成，為脊髓白質神經網絡重建提供了結構基礎，也為脊髓損傷修復過程中軸突尋徑提供了良好的方向。

Tien等[21]通過將絲素蛋白涂覆于柔性皮質電極，制備了在水合作用時從剛性轉變為柔性的裝置；體外測試表明，絲素蛋白膜涂層具備使電極穿透腦組織的機械性能，可減少膠質瘢痕的產生，提高電極的可靠性。此研究的應用范圍超越了穿透電極，為絲素蛋白在許多中樞神經系統的應用奠定了基礎。

趙曉陽等[22]利用聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜，增加絲素蛋白中帶正電荷的基團，并通過神經干細胞（NSCs）的生長及分化的情況判斷絲素蛋白對神經干細胞的影響。利用Real-time PCR分析發現，修飾后的絲素蛋白膜上細胞分泌神經營養因子BDNF水平更高，更利于神經和軸突再生。結果表明，聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜能夠促進NSCs的增殖活性并減少NSCs細胞凋亡，促進NSCs向神經元方向分化，可為NSCs的附著和生長分化提供良好的生長表面。

Gisbert等[23]通過將透明質酸和絲素蛋白結合制成的管狀支架作為神經導管，同時接入施萬細胞進行培養；結果顯示，加入絲素蛋白后的支架培養的細胞黏附性和增殖率高于純透明質酸鈉。細胞增殖率的提高加速了致密細胞層的形成，該致密細胞層覆蓋于HA-SF管的內通道表面。研究表明，該支架在大鼠體內培養后可生成新的膠原細胞外基質和新的血管，促進神經組織的再生。

2.3 血管修復

血管再生是一個高度復雜的過程。在多種組織損傷修復過程中，再生血管可改善創面循環，為組織再生提供基礎。血管再生的加快在一定程度上表示組織修復的加快，利用組織工程可制造人工血管，縮短了血管再生的進程。絲素蛋白中特殊的氨基酸排列結構使其具有抗凝血功能，且與合成材料相比，具有更好的生物相容性，可應用于人造血管，更有利于血管內皮化。

Liu等[24]采用絲素蛋白凍干支架再滲透的方法，在絲素蛋白支架中引入鐵基磁性納米顆粒（MNPs），制備了一種新型磁性絲素蛋白支架（MSFC）。與絲素蛋白支架（SFC）相比，該新型支架具有更好的結晶度、磁熱性能和機械強度。體內、外試驗表明，MSFC的降解時間明顯延長，具有良好的生物相容性和促進血管內皮細胞（VECs）生長的作用。該研究證實，引入MNPs在SFC和MNPs間形成了氫鍵，可顯著增強絲素蛋白支架的機械強度，減緩降解速率，促進VECs增殖，有利于長距離血管的修復。

Samal等[25]利用冷凍干燥絲素蛋白及乙醇誘導結晶，制備成三維多孔結構的絲素蛋白支架，在支架中接入人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs）和成纖維細胞進行共培養，形成毛細血管樣結構。通過體內、外試驗結果顯示，絲素蛋白支架共培養的血管內皮生長因子（VEGF）水平較高，具有較好的細胞黏附力和增殖能力，血管內皮生長因子受體（VEGFR2）的表達增加，表明這些支架與纖維蛋白結合為毛細血管樣結構的形成提供了合適的微環境，能夠更好地發展血管網絡。

錢春雨[26]將瘦蛋白負載于絲素蛋白，構建了可促進血管愈合并調節血管生成的絲素蛋白纖維膜。試驗采用靜電紡絲技術制備了絲素蛋白纖維，通過聚多巴胺表面接枝包裹瘦蛋白的脂質體，制成絲素蛋白纖維膜，負載瘦蛋白的絲素纖維具有良好的細胞相容性。體內試驗結果顯示，將該絲素纖維膜應用于兔口腔黏膜損傷，與對照組相比，負載瘦蛋白的絲素纖維膜愈合情況最快，且愈合后的組織切片顯示新生的黏膜分層明顯，CD34信號明顯；表明負載瘦蛋白的絲素蛋白纖維膜能夠有效地促進血管再生，提高口腔黏膜缺損修復速度。

曹傳寶等[27]通過調節模具轉速、干燥溫度、涂覆層數及模具直徑控制人造血管的性能及形狀，發明了一種抗凝血性改性的絲素蛋白小口徑人工血管的制備方法。此技術可根據實際需要制備具有不同力學性能和外形的絲素人造血管，得到的絲素蛋白人造血管具有良好的血液暢通率、生物相容性、血液相容性和較高的機械強度等優點。

2.4 骨組織及軟骨組織修復

盡管組織工程取得了重大進展，但骨、軟骨修復在目前的臨床實踐中仍然是主要的挑戰。骨、軟骨單元是一個完整的功能整體，其組成、結構和功能特性不同，故骨、軟骨的再生一直是難點。利用組織工程支架模擬骨組織的結構和功能，可實現對骨、軟骨組織的修復甚至替換。絲素蛋白因其獨特的力學性能、可調節的生物降解速率和負載細胞能力，可作為一種良好的骨組織工程支架材料[28]。

Li等[29]通過將力學性能和生物相容性好的絲素蛋白與?-聚己內酯復合，以Sr2+為生物活性因子，制備了半月板支架（SP-Sr）。SP-Sr植入半月板全切除的兔6個月的磁共振成像結果顯示，與其他組相比，SP-Sr可有效防止半月板擠壓，緩解關節間隙狹窄；通過病理檢查證實，其具有軟骨保護和延緩骨關節炎發展的作用。支架植入6個月后，新半月板表現出相似的結構成分和力學性能。試驗采用濕法電紡法制備的半月板支架具有合適的孔徑和足夠的機械支撐力，通過一系列材料表征測試和體外細胞研究，證明了無細胞三維電紡PCL、絲素蛋白、Sr2+支架具有保護軟骨、延緩骨關節炎發展的作用。

Han等[30]利用絲蛋白支架中植入過表達組蛋白去甲基化酶（PHF8）的骨髓間充質干細胞，在小鼠顱骨中形成臨界大小的骨缺損，將表達PHF8修飾的骨髓間充質干細胞植入絲素蛋白支架內，填補至顱骨缺損中。術后2 w，缺損處有少量新骨形成；5 w后，缺損處的新骨形成明顯多于其他組。結果表明，絲素蛋白支架內植入PHF8修飾的骨髓間充質干細胞可共同促進小鼠顱骨缺損的骨再生。

Wu等[31]設計了一種結合光固化絲素蛋白密封劑，應用于骨、軟骨修復的一體化雙層支架的新設計，研究構建了一種以致密、光滑的仿生軟骨層（D/S）和負載了BMP-2的多孔層（P/S）為主體，采用負載TGF-β3的絲素蛋白水凝膠（TGF-β3/SilMA）進行邊緣填充與密封的完整雙層絲素支架。此雙層絲質支架軟骨層在表面形態和機械強度上類似天然軟骨以及bmp-2負載的多孔軟骨下骨層，有助于骨髓間充質干細胞成骨分化。負載TGF-β3的甲基丙烯酸絲素密封膠顯示生物相容性和良好的黏附性能，并被證實能夠促進軟骨細胞遷移和分化。在膝關節修復早期，負載TGF-β3的SilMA水凝膠提供了支架軟骨層與周圍軟骨之間的橋梁，引導新軟骨向周圍原生軟骨降解軟骨層方向生長并取代降解的軟骨層。因此，在體內通過使用此復合材料可實現骨軟骨再生和外側整合。結果表明，絲素蛋白復合材料支架通過內源性細胞實現骨軟骨修復，是一種潛在的骨軟骨修復支架。

Hong等[32]利用甲基丙烯酸縮水甘油酯改性絲素蛋白（SilMA），合成了一種光固化生物墨水材料。研究發現，SilMA具有優秀的載細胞數字化（DLP）打印性能、良好的成軟骨能力及與天然軟骨相匹配的機械性能。試驗對SilMA的軟骨形成能力進行了體外評估和體內應用。利用DLP 3D打印機的快速打印速度和光聚合作用，使3D產品的細胞分布均勻。SilMA與細胞混合后在體外培養4 w后，通過共聚焦顯微鏡觀察到囊化細胞分化成軟骨細胞。此外，對部分缺陷氣管兔模型的體內試驗顯示，在氣管周圍發現了新的軟骨樣組織和上皮。該研究表明，負載軟骨細胞的SilMA培養系統打印系統提供的水凝膠可促進軟骨再生。同時，SilMA水凝膠具有很高的拉伸強度，濃度為30%時，其拉伸斷裂應力可達50 kPa，優良的機械性能使其可經受簡單的外科縫合而不撕裂。因此，利用DLP 3D打印機制備的SilMA水凝膠可應用于需要打印性等力學性能的軟骨組織工程領域。

Kim等[33]采用甲基丙烯酸縮水甘油酯改性絲素蛋白，通過DLP打印機制備了環狀軟骨氣管，并進行了體外試驗。試驗結果顯示，該軟骨器官在體外培養后有軟骨組織形成，蘇木精-伊紅（HE）染色可觀察到細胞均勻分布于SilMA水凝膠上，細胞陷窩嵌在嗜堿性細胞外基質中；同時，軟骨細胞密集，伴腔隙，周圍基質呈進行性染色。在熒光顯微鏡檢查中，軟骨細胞在體外生長時間長達4 w。該試驗還評價了30%SilMA水凝膠的降解率及其在DLP打印中的潛在價值，結果顯示，載細胞的SilMA水凝膠逐漸降解，培養4 w后降解率達到50%，表明硅溶膠凝膠為軟骨細胞的生長和軟骨形成提供了良好的體外環境。

Li等[34]采用低溫擠壓3D打印技術，通過辣根過氧化物酶（HRP）介導的絲素蛋白和酪氨酸取代明膠（GT）的交聯，制備了大孔SF-GT水凝膠支架。通過物理化學表征分析，發現該水凝膠具有良好的結構穩定性和合適的力學性能，可調節的降解速率，可滿足軟骨重建的要求。采用細胞懸浮和聚合播種的方法評價了水凝膠支架的細胞接種效率，并對干細胞的軟骨分化情況進行了探討。結果顯示，采用細胞聚集播種法時，水凝膠支架中的干細胞分化為透明軟骨；采用細胞懸液法時，干細胞分化為纖維軟骨，并在兔軟骨缺損模型中研究了水凝膠和干細胞的軟骨修復作用。該大孔SF-GT水凝膠支架負載干細胞聚集物在軟骨組織修復和再生方面具有良好的應用潛力。

3 結論

絲素蛋白可與其他生物材料結合形成復合支架，模擬自然體內環境，提高支架的體內融合潛力，植入目的細胞加速創傷部位的愈合、新生等。絲素蛋白可改性成不同的支架，如可注射和可打印凝膠、多孔海綿和靜電紡絲二維、三維結構，通過新的改性技術可預期絲素蛋白基支架具有更多的可能性。

絲素蛋白材料在組織修復領域的應用促進其在生物材料領域的研究，但仍有許多未解決的問題，如目前大多數研究僅限于動物試驗，距離真正意義上的臨床應用還有很長一段距離；純絲素蛋白材料缺乏實用性，大多數絲素蛋白需要通過與其他材料復合改性后才能夠發揮絲素蛋白的最大優勢，制備既保持絲素蛋白原有特性又具有實用性的絲素復合材料是目前主要研究方向之一。隨著研究的持續深入，絲素蛋白將為組織工程領域開辟更多元化的發展空間。