ITS序列分析在常見動物皮膚癬菌分類鑒定中的應用

阮晨梅

（四川民族學院，四川康定 626000）

皮膚癬菌病是一種淺部真菌感染性皮膚病，呈全球性流行，根據流行區域不同，致病菌種類有所不同。根據生態學分類方式，皮膚癬菌主要分為親人性、親動物性、親土壤性皮膚癬菌[1]。親動物性皮膚癬菌常寄居于動物的皮膚被毛，可通過直接或間接接觸傳播，不僅在動物間相互傳播，在動物與人、人與人之間也廣泛傳播，危害較大且不易防治。隨著人類生活水平的提高，動物與人的關系愈發密切，由動物皮膚癬菌傳染人引起的人獸共患癬菌病也愈發常見。因此，探索高效分類鑒定皮膚癬菌的方法對指導臨床治療具有重要意義。

在針對真菌的鑒定中，內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術屬于一種不依賴病原微生物分離培養的高效分析技術，因其快速、簡便和高特異性，顯示出極大優勢[2]。ITS序列分析技術不受抗生素的影響，能夠鑒定出死亡微生物和目前人工難以培養的微生物。通過ITS序列分析可快速鑒定患病動物感染的致病真菌，進一步指導獸醫臨床用藥。

1 ITS序列

1.1 ITS序列的結構

皮膚癬菌的核糖體DNA以串聯重復方式構成，由核糖體基因18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA及其相鄰的外轉錄間隔區（external transcribed spacer，ETS）、ITS、基因內間隔序列（intergenic spacer，IGS）構成[3]。ITS序列是位于真菌18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的非編碼轉錄間隔區，包括位于18S rDNA、5.8S rDNA之間的第一內轉錄間隔區ITS1和位于5.8S rDNA、28S rDNA之間的第二 內 轉 錄 間 隔 區ITS2[4]。18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA的基因結構保守穩定，異種間存在廣泛同源性。對比而言，內轉錄間隔區ITS1和ITS2在核糖體RNA的加工過程中常被剪切，在進化過程中受到的自然選擇壓力小，具備更快的進化速度，具有廣泛序列多態性，可應用于種間分類的信息位點。

1.2 ITS序列的特點

ITS序列片段短小，具有重復的多拷貝特性，易于獲取與分析，特別適合皮膚癬菌屬、種級的系統發育和分類研究[5]。鑒定皮膚癬菌的種類時，可根據屬種間高變區或特異基因設計特異性引物，直接鑒定至種群水平。研究過程中，常結合病原菌菌落形態學特征、生長特性、生理生化指標等傳統分類鑒定方法，提取皮膚癬菌DNA對ITS基因序列進行測序分析，對病原菌的種類進行高效鑒定[6]。結合16S rRNA和18S rRNA基因序列特點，運用高通量測序技術可對動物皮膚樣品進行微生物α多樣性分析和菌群結構組成分析。有研究表明，了解患病動物病灶微生物多樣性情況可為疾病的防控和臨床指導用藥提供參考[7]。

2 ITS序列分析在常見動物皮膚癬菌分類鑒定中的應用

皮膚癬菌是動物淺部真菌性皮膚病的常見致病真菌，主要寄生于動物的表皮角質和毛發中，可在動物與人之間傳播。根據皮膚癬菌中大分生孢子和菌絲結構的不同，可將其分表皮癬菌屬、小孢子菌屬和毛癬菌屬[8]。不同菌屬的皮膚癬菌感染特異性不同，毛癬菌屬常侵犯動物機體皮膚、趾甲和毛發，小孢子菌屬易侵犯動物機體皮膚和毛發，表皮癬菌屬侵犯動物機體的皮膚和甲。

3個屬中對動物皮膚有致病作用約30余種，在形態特征、生理生化特征上均存在一定的差異。報道常見的致病菌包括疣狀毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌，臨床診療上需要與皰疹病毒感染及其他深部真菌病相區別。臨床上常采用熒光染色法和KOH濕片法對淺表真菌進行鏡檢，但是通過傳統的分類鑒定方法區別難度較大，且很難鑒定到種水平[9]。ITS序列分析能夠在較短的時間內對動物常見的皮膚癬菌進行分類鑒定，以便獸醫臨床上對動物皮膚癬菌病的快速診斷和治療。

2.1 疣狀毛癬菌

疣狀毛癬菌是一種獸醫臨床上常見的親動物性真菌，家畜中牛、山羊、綿羊均易感。臨床上炎癥表現明顯，患病動物頭、頸、軀干側面皮膚常出現脫毛、灰白色痂塊。疣狀毛癬病嚴重影響動物生長發育，降低機體抵抗力[10]。疣狀毛癬菌在SDA培養基上生長速度較慢，加入維生素B1和肌醇后真菌菌落的生長速度明顯提升。分離純化后的疣狀毛癬菌在沙氏培養基上培養1 w可觀察到菌落呈灰白色、乳白色或淺黃色，背面未見明顯的特征性色素，中心蠟狀成堆，邊緣呈“杉樹堆”，光鏡下可觀察到鏈狀厚膜分生孢子和鹿角樣的菌絲分支。

吳潤標等[11]采集患病黑山羊病變皮屑進行病原分離，根據GenBank收錄的絲狀真菌ITS基因設計皮膚癬菌ITS基因通用引物，測序分析顯示目標菌ITS基因序列與Pchelin公布的嗜動物性疣狀毛癬菌（T.verrucosum）同源性高達99.99%，結合真菌菌落形態、孢子和菌絲結構確定目標菌為疣狀毛癬菌。葛松等[12]對病原真菌ITS序列進行同源性比較鑒定，結果顯示，寧夏地區患真菌性皮膚病肉牛的病原真菌與疣狀毛癬菌同源性高達99%，系統發育樹上屬同一分支。基于ITS序列分析，王建昌等[13]確定2013—2014年河北進口奶牛皮膚真菌病患牛分離得到的真菌中有10株疣狀毛癬菌，其DNA條形碼鑒定結果同形態學鑒定結果一致。

2.2 須癬毛癬菌

須癬毛癬菌是一種常見于人和動物的致病真菌，臨床上患病皮膚常出現被毛折斷、圓環狀脫毛、大量灰白色鱗屑脫落、炎性變化、結痂等病理現象。須癬毛癬菌是一個菌種的復合體，在種內包含許多不同的分型，在形態學上和宿主上呈現多態性[14]。

菌株組成、分型方法的敏感性以及選用標記分子的不同均可得到不同的須癬毛癬菌基因分型結果。根據SDA培養基中菌落的形態特征、尿素酶試驗、葡萄糖米飯試驗、體外毛發穿孔試驗、螺旋菌絲和大小分生孢子鏡下結構，可將須癬毛癬菌分為羊毛狀、緊密狀、絨毛狀、粉末狀、顆粒狀等5個表型[15]。基于含錳超氧化歧化酶（MnSOD）基因序列，對14株人源須癬毛癬分離株和27動物源須癬毛癬分離株進行系統發育分析，可將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5個基因型[16]。基于幾丁質酶基因序列同源性差異，可將31株兔源須癬毛癬菌分為5種基因類型；根據菌落形態特征分為顆粒型、粉末型和絨毛型等3種表型[17]。

通過ITS區段和LSU區段分子生物學序列分析，可對狐貍源性菌株的種和有性型做出明確鑒定[18]。劉彥威等[19]利用rDNA-ITS序列分析，結合真菌形態學對河北省兔場患病兔病原菌分離鑒定出兔萬博節皮菌。利用通用引物ITS1和ITS4進行PCR鑒定及系統發育學分析，發現趾間毛癬菌為大熊貓被毛樣本的優勢菌種[20]。

以ITS轉錄間隔區為靶位，對分離自不同部位的須癬毛癬菌復合體PCR擴增后測序，采用最大似然度法進行序列分析構建系統進化樹；結果顯示，受試菌株和趾間毛癬菌聚類于同一主支的概率為98%，歸類于有性期為萬博節皮菌的趾間毛癬菌[21]。

2.3 犬小孢子菌

犬小孢子菌屬真菌叢梗孢科中的小孢子屬，是一類分布廣泛的親動物性真菌，在我國真菌病重發病率較高。臨床上犬小孢子菌常引起頭癬，其對皮膚毛發的損傷大，炎癥反應明顯[22]。犬小孢子菌在葡萄糖蛋白胨培養基上培養后，可觀察到菌落從黃白色絲狀到白色羊毛狀的變化；在馬鈴薯葡萄糖培養基上培養可觀察到黃色的特征性色素；在米飯培養基上可觀察到較多的大分生孢子。鏡檢犬小孢子菌可觀察到絲狀或球拍狀菌絲，頂端膨大呈紡錘形沿菌絲排列的大分生孢子，呈杵狀或葡萄狀沿菌絲排列的小分生孢子。

劉亭亭等[23]利用ITS序列分析從東北虎林園的東北虎身上鑒定出1株犬小孢子菌。崔麗娜等[24]利用ITS序列通用引物，對山東地區主要兔場的皮膚真菌病分離菌ITS區序列變異及遺傳進化關系分析，確定該地區存在犬小孢子菌的流行。李鋒等[25]從1例皮膚病患犬體表分離培養病原菌，經形態學初步鑒定后，采用真菌鑒定通用引物ITS1、ITS4對分離菌的ITS區序列進行PCR擴增測序分析；結果顯示，分離菌與Gen Bank中的犬小孢子菌（ATCC 36299）的ITS序列（FJ 385030.1）相似性為99%，且在系統發育樹上屬同一分支。夏繼寧等[6]從臨床收集的39株皮膚癬菌樣本中使用通用引物ITS1和ITS4擴增ITS靶基因，經BLAST工具比對分析，顯示其中5株樣本菌為犬小孢子菌，且與表型鑒定結果相吻合。有研究利用rDNA ITS測序分析，進一步證實了PCR-HRM分析方法獲得的HRM溶解曲線可應用于臨床上紅色毛癬菌、指（趾）間毛癬菌、犬小孢子菌、堇色毛癬菌等4種皮膚癬菌的初步鑒定[26]。

2.4 石膏樣小孢子菌

石膏樣小孢子菌與犬小孢子菌同屬于小孢子菌屬，具有親土壤性，易感動物可通過接觸污染土壤感染。患病動物出現脫毛、斷毛，鱗屑，脫毛部位皮膚結痂的現象。

石膏樣小孢子菌在SDA培養基上生長迅速，可觀察到菌落顏色從白色到棕黃色，形態從絨毛狀到粉末狀的變化。觀察菌落顏色可見中心色深，邊緣色淺。鏡檢可觀察到少量呈球拍狀、結節狀、梳樣的菌絲，有棘狀突起、壁薄粗糙、橢圓形或梭形的大分生孢子，長于菌絲一側的桿狀無梗小分生孢子。

李明勇等[27]通過分離青島地區患病兔病原真菌并對其ITS序列進行分析鑒定，表明石膏樣小孢子菌在家兔中廣泛存在。石膏樣小孢子菌不僅存在于家畜中，在一些野生動物中也有分布。為研究大熊貓皮膚病的病因，中國大熊貓保護研究中心對患皮膚病的大熊貓進行了真菌分離及形態學鑒定，并通過ITS序列分析鑒定出分離株為石膏樣小孢子菌[28]。錢晶等[29]根據石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、須毛癬菌ITS序列差異設計4條引物，建立多重PCR方法可同時檢測3種致病性真菌，方法簡便、特異、靈敏，可同時對寵物淺表真菌病原作出快速診斷與鑒別。

2.5 其他皮膚癬菌

ITS序列分析在斷發毛癬菌、馬毛癬菌、紅色毛癬菌等皮膚癬菌的分類鑒定中也存在少量應用。基于菌株表型和基因型特征，在rDNA ITS和TEF1序列分析下，表明感染馬毛癬菌的無癥狀患犬可將病原菌傳播給人類[30]。觀察有寵物犬接觸史的成人頭部膿癬患者，取其皮損邊緣少量分泌物分離培養，觀察菌落形態結構，選取真菌培養后菌落提取DNA，擴增ITS區；結果顯示，測序分析ITS序列片段和斷發毛癬菌的內轉錄間隔區MH877348.1相似性達到100%[31]。利用紅色毛癬菌保守區域rDNA ITS區域設計特異性引物，可快速、準確、敏感地區分紅色毛癬菌與其他皮膚癬菌[32]。

3 結論

隨著分子生物學的不斷發展，皮膚癬菌分類鑒定的方式不再局限于傳統的菌株形態特征和生理生化指標鑒定。ITS序列分析的應用在一定程度上彌補了傳統方法中主觀經驗的影響，使鑒定更加快速、簡單、客觀。但ITS序列分析無法對所有真菌的屬種進行鑒別，在實踐應用中也存在缺陷，尤其在比對使用的基因庫缺乏與待檢真菌親緣關系相近的已知真菌時。因此，在臨床中還需要將傳統的真菌學鑒定法與ITS序列分析相結合才能更好地指導實踐。真菌ITS序列具有種間特異性，使其在動物皮膚癬菌的分類鑒定及動物癬菌病的預防治療中發揮非常重要的作用，在動物皮膚病的臨床醫學檢驗中具有廣闊的應用前景。