骨關節炎的可溶性生物標志物研究進展

李建平，張鳳綜述 彭飛審校

骨關節炎(osteroarthritis,OA)是老年人最常見的關節疾病，全世界有2.5億人患病，并給整個社會和經濟帶來了巨大的負擔[1]。骨關節炎生物標志物是關節組織轉換產生的分子碎片，并釋放到滑膜液、血液和尿液中，它們具有獨特的動態變化、高敏感度和易于測量的特點，這些特性可能會克服目前評估OA方法的一些局限性，其中包括常規可溶性生物標志物、蛋白源性可溶性生物標志物、X型膠原可溶性生物標志物、軟骨寡聚基質蛋白新表位、活性酶、骨膜蛋白、小分子核糖核酸，它們的出現為OA的診斷和預后提供幫助。本文對傳統和最新的生物標志物的生化特征進行綜述，并評估它們是否能解決目前OA治療中的不足。

1 關節組織中常規的可溶性生物標志物

常規的生物標志物是用常規生物化學技術發展出來的生化指標，它們從組織中釋放的確切結構和過程并不明確。主要的常規標志物詳細描述并分為5類:疾病嚴重性、研究價值、預后、療效和診斷，而所謂的BIPED分類是指合成代謝或分解代謝的標志物，即使這種區分并不總是完全準確的[2]。因為Ⅱ型膠原是軟骨基質的主要有機成分，所以對軟骨Ⅱ型膠原的形成和降解得到了廣泛的研究。Ⅱ型膠原形成之前是通過測量血液中C端和N端肽(分為PⅡCP和PⅡNP)的水平來評估的。當前膠原轉化為成熟的Ⅱ型膠原時，這些前肽被特定的蛋白酶剪切。PⅡNP以2種剪接替代形式存在，不同的是由PⅡNP高表達(PⅡANP)或PⅡNP低表達(PⅡBNP)。一種測定血清PⅡANP的方法已經開發出來，通常在胚胎中表達陰性但在OA軟骨中表達相反。PⅡBNP主要在健康成人Ⅱ型膠原形成過程中表達。雖然PⅡANP和PⅡBNP應該反映相同的代謝過程，但是PⅡANP和PⅡBNP在來自OA患者的相同樣本中評估時沒有顯著相關性。然而，與正常人相比，OA患者血液中這2種物質的水平均下降[3]。

2 關節組織中新的可溶性生物標志物

2.1 蛋白源性可溶性生物標志物 最近，研究人員已經開始研究參與影響膠原形成的酶，這些酶用作第二代生物標志物，其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原酶，但是這些標志物具有不穩定性的缺點。研究者發現，許多方法可以直接或間接檢測Ⅱ型膠原的存在[4]。研究指出Ⅱ型膠原生物標志物特異性抗體的識別受到脯氨酸羥基化的影響。OA中新合成的軟骨中羥脯氨酸的含量高于正常軟骨，這表明羥基化水平間接反映Ⅱ型膠原降解水平。因此，科學家們隨后開發了三明治CIINE分析，識別膠原酶切割的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原的C端新表位，并對羥基化和非羥基化形式具有相似的親和力。研究通過人尿夾心試驗IB-C2C-HUSA的結果指出C端新表位序列與用于捕獲抗體的CIINE的序列非常相似[5]。研究用CIIM檢驗Ⅱ型膠原的降解，這種方法可以產生更多的降解產物，因此可以在血清中測量[6]。CIIM和CTX-Ⅱ在OA患者軟骨較正常者軟骨高表達。EILCA法也可以檢測血清CTX-Ⅱ。然而，在一項膝關節OA患者的研究中，血清CTX-Ⅱ水平與尿液CTX-Ⅱ水平不相關[7]。Ⅲ型膠原酶代謝也會影響骨關節炎的產生，檢測方法分別為COL3-ADAMTS測定方法、競爭性Pro-C3檢測、競爭性C3M檢測和IIINys檢測，這些標志物的差異性表達與OA的發生相關。

2.2 Helix-Ⅱ可溶性生物標志物 Helix-Ⅱ是最初用于測量人類Ⅱ型膠原降解的生物標志物。雖然用于檢測Helix-Ⅱ片段的抗體早已發現，但是通過對人類軟骨Ⅱ型膠原的直接測序證實之前公布的序列是不正確的，因此，Helix-Ⅱ對Ⅱ型膠原的特異性受到質疑。研究證實，4-羥脯氨酸的存在是Helix-Ⅱ抗體識別的關鍵[8]。因此，Helix-Ⅱ抗體的一個潛在靶點是Ⅲ型膠原，因為4-羥脯氨酸都存在于人類Ⅲ型膠原序列中。而Ⅲ型膠原在人軟骨基質中大量存在，故檢測起來相對簡單。大量的實驗數據表明，Helix-Ⅱ是評估關節炎中關節組織改變的一個有價值的標記。與性別和年齡匹配的健康對照組相比，膝關節OA患者和早期RA患者的尿液Helix-Ⅱ水平顯著升高，經歷抗腫瘤壞死因子治療1個月后，血清Helix-Ⅱ水平下降明顯。而在髖關節早期OA患者中，尿Helix-Ⅱ和尿CTX-Ⅱ聯合測量比單獨測量任何一種標志物更有效地發現疾病[9]。這種關系可能是由于Helix-Ⅱ和CTX-Ⅱ在OA軟骨基質中的不同定位，以及它們從人類軟骨膠原中產生的分解代謝酶的不同方式[10]。此外，由于Ⅲ型膠原既存在于滑膜組織，也存在于軟骨組織，這使得Helix-Ⅱ成為OA獨特綜合生物標志物[11]。

2.3 Ⅹ型膠原可溶性生物標志物 X型膠原是一種非纖維性膠原，也是人OA軟骨中高表達的肥厚軟骨細胞分化的標志物，其中包含NC1結構域和膠原區域的可變部分，其核心為C-Col 10[12]。研究發現，與正常人相比，OA患者血清C-Col 10水平也與血清C2M水平顯著相關，表明軟骨細胞肥大與關節軟骨降解密切相關[13]。最近研究利用氣相色譜和質譜技術在OA患者的尿液中鑒定出組織蛋白酶K生成的Ⅹ型膠原螺旋部分的新表位，稱為Col-10 neo[14]。在另一項研究中發現，OA患者的血漿Col-10 neo水平高于正常人[15]。在過去的幾年里，針對由特定酶產生的Ⅱ型膠原新表位的第二代降解標記已經開發出來，并專門用于檢測軟骨基質中Ⅲ型和Ⅹ型膠原的降解。然而尚不清楚它們是否可以作為替代或比目前更成熟的膠原生物標志物聯合用于評估OA患者。

2.4 全軟骨寡聚基質蛋白(total cartilage oligomeric matrix protein,COMP)、D-COMP、COMP新表位 COMP是關節軟骨的一種非膠原蛋白。根據BIPED分類，血清COMP水平與OA疾病的診斷、疾病預后相關[16]。以往研究指出，血清COMP水平可以預測疼痛患者OA的發生率[17]。D-COMP是COMP蛋白的脫氨基形式。血清D-COMP水平與髖關節OA的嚴重程度相關，但與膝關節OA無關。相反，血清中總COMP水平與膝關節相關，而與髖關節無關，這表明D-COMP可能是關節特異性的[18]。最后，研究出2種針對總COMP和COMP新表位的自動檢測方法。這2項檢測的比值可以區分膝關節和髖關節OA患者的診斷[19]。

2.5 活性酶 目前已經開發了多種方法能夠測量可能與OA疾病有關的活性酶的濃度，特別是組織蛋白酶K和MMP-3的活性形式[20]。這2種酶都是作為原酶合成的，在激活過程中，信號肽被剪切，產生被特異性抗體識別的蛋白水解新表位，包括adamts-4、adamts-5、MMP-3和MMP-9。現研究出針對adamts-4、adamts-5、MMP-3和MMP-9的特異性檢測方法。由于酶在體內廣泛分布，預計當在血清中測量時，這些標志物對關節組織缺乏特異性[21]。此外，由于循環中活性酶的濃度很低，這類生物標志物的敏感度可能會受限。顯然，活性酶濃度和OA之間的關系需要進一步的研究。

2.6 骨膜蛋白(POSTN) POSTN是由成骨細胞和軟骨細胞合成的分泌蛋白，在軟骨下骨和軟骨基質之間對OA產生影響，貫穿OA疾病的全程[22]。在一項絕經后婦女的前瞻性研究中，膝關節OA患者血清POSTN水平顯著低于對照組[23]。在另一項研究中，膝關節OA患者和對照組的血漿POSTN水平沒有顯著差異，但此項研究中POSTN采用不同的測定方法評估[24]。在以往研究中大量來自蛋白質或蛋白質片段的標志物已經開發出來。然而，只有少數對幾個特征明顯標志物進行了臨床研究。為了分析它們在OA管理中的潛在臨床效用，這些新的檢測方法需要在技術上得到改進。

2.7 小分子核糖核酸 表觀遺傳學是遺傳學的一個領域，細胞表型的變化被認為是由調節基因活動的外部因素造成的。MicroRNAs(miRNAs)可能在OA中發揮關鍵作用，因為其中一些是參與軟骨發育、穩態和骨關節炎病理的基因調控因子。一些體外和體內的研究已經證明，miRNA參與了OA的發生和進展，到目前為止，已證明46個miRNA與OA相關[25]。與對照組相比，患有輕度至中度OA的絕經后女性血清miR-146a-5p表達增加。重要的是，血清miR-186在未來4年將出現膝關節OA的女性中也會增加，因此它可能有能力檢測膝關節OA的臨床前水平[26]。研究人員還發現，與健康人相比，OA患者軟骨中miR-146-5p顯著上調，血清miR-146-5p水平升高，證實了該miRNA作為OA生物標志物的臨床應用價值[27]。近期發現與對照組相比，OA患者的滑膜液中miR-140和miR-199水平下調，并與OA疾病的進展呈負相關，提示miR-140和miR-199可能通過調節MMP-3和IL-1β mRNA的表達影響相關金屬蛋白酶和細胞因子的表達水平[28-29]。最后，長鏈非編碼RNA可以影響OA發生和發展。表觀遺傳學極大地拓展了對OA發病機制的分子機制的認識。在一些小規模的研究中已經建立了一些miRNA標記，但在更大規模的研究中還有待研究。

3 影響OA診治的可溶性生物標志物

3.1 影響OA表型的可溶性生物標志物 在過去的幾年里，在OA疾病表征方面的重要進展是將患者分為幾種臨床表型。表型對應一組具有某種疾病的共同可觀察特征的患者，如形態學、發育、生化或生理特性或行為。這些表型會涉及特定的分子通路。而且OA是一種復雜的疾病，其表型可能是多種失調通路的結果。OA的表型包括炎性反應表型、代謝綜合征表型、滑膜液表型和骨表型[30-32]。炎性反應表型的標志物包括血清hs-CRP、CRPM、C3M和內脂素，代謝綜合征表型的標志物包含MMP-1、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10和MMP-12[33-34]，上述標志物的升高促進OA的發生。滑膜液表型升高促進OA發生發展[35]。骨表型包括α-CTX-Ⅰ表位和CTX-Ⅱ表位，這些表位表達增加對OA具有高骨轉換狀態的患者診斷有效[36]。疼痛的表型包括ADAMTS-5酶、TNF-α水平、IL-6、IL-8、血清COL3/ADAMTS水平，它們的升高對OA診斷具有幫助[37]。雖然許多表型已經提出，但目前用于這些表型的可溶性標志物似乎更有限。如果臨床試驗能將OA患者的表型與藥物靶向的分子途徑相對應，那么潛在藥物的效果將更容易發現。

3.2 影響OA治療、預后、發展的可溶性生物標志物 影響早期OA預后的生物標志物包括血清COMP、透明質酸(HA)和Ⅰ型膠原交聯N端肽(NTX-Ⅰ)、血漿葡萄糖烷、血清C2M、尿Coll2-1 NO2、血清C1M和尿CTX-Ⅱ，這些物質在早期OA中增加。影響OA發展的生物標志物包括血清PRO-C2、HA、IL-1、ARGS、PⅡANP、TLR4、COMP，尿CTX-Ⅱ、凝聚素肽、光蛋白聚糖、潤滑素、彈性蛋白酶和滑液中TGF-β1水平，這些標志物在預測膝關節或髖關節OA疾病進展方面有效[38]。雖然一些臨床和放射學研究證明其具有OA治療的生物學價值，但是它們的敏感度和特異度差。因此，生物標志物具有互補的作用。研究發現，關節組織轉換的生物標志物可能對OA治療有幫助。研究表明，血清COMP水平升高的OA患者較血清COMP水平較低的患者治療效果好[39]。有些生物標志物可以影響OA治療效果，如血清CTX-Ⅱ、YKC-40、COMP和尿CTX-Ⅱ、NTX-Ⅰ，它們的降低對OA的治療有很大幫助[40]。

4 小結與展望

上述研究表明，生化標志物可能成為評估OA診斷、治療和預后的基石。雖然發現有很多生物標志物影響OA，但臨床數據不全面阻礙其發展。提高生化標志物效能的方法是充分挖掘它們的生物學基礎并進行大規模的臨床研究。希望未來的研究解決上述缺陷，為OA患者提供更好的診斷、治療、預后措施。