伏立諾他協同NVP-BEZ235誘導人外周血白血病T細胞凋亡探究

陳 明，肖 紅

(湖南省湘潭市第一人民醫院血液科，湖南 湘潭 411101)

急性T淋巴細胞白血病是一種常見的造血系統的惡性腫瘤，預后較差[1]。PI3K/Akt是與血液系統腫瘤密切相關的信號通路。研究證明，在急性T淋巴細胞白血病中的PI3K/Akt異常活化[2]。臨床證實，針對PI3K/Akt的靶向治療能夠有效延緩腫瘤的發生發展[3]。NVP-BEZ235是一種新型 PI3K信號通路抑制劑，能夠抑制急性T淋巴細胞白血病[4]。伏立諾他是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，現已廣泛用于治療白血病，能夠協同卡非佐米和貝沙羅汀等抑制T細胞白血病細胞[5]。研究伏立諾他聯合NVP-BEZ235用藥誘導人外周血白血病T細胞(Jurkat細胞)凋亡及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人外周血白血病T細胞(Jurkat細胞)購自中國典型培養物保存中心。伏立諾他和NVP-BEZ235購自默克公司。鼠抗人抗體β-actin抗體、鼠抗人Bim1抗體購自Santa Cruz公司。鼠抗人total-FOXO3a抗體、鼠抗人磷酸化FOXO3a抗體、鼠抗人total-Akt抗體和鼠抗人磷酸化Akt抗體購自Cell signaling公司。siRNA由廣州瑞博合成。

1.2 細胞培養和凋亡檢測

將Jurkat細胞接種到含0.1 g/L鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，放置到5% CO2、37℃恒溫條件培養。將生長旺盛的Jurkat細胞濃度調整為3×105個/mL，繼續培養24 h。用伏立諾他(0.48 μmol/L)、NVP-BEZ235組(24 nmol/L)聯合用藥(0.48 μmol/L伏立諾他+24 nmol/L NVP-BEZ235)及陰性對照(等體積DMSO)處理48 h。使用流式細胞儀技術，檢測用藥后Jurkat細胞的凋亡情況。

1.3 Western blot 檢測蛋白表達及磷酸化

收集各組細胞并用蛋白提取試劑裂解，將蛋白提取物用14 000 rpm離心15 min，進行SDS-PAGE，并將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。使用含5%脫脂奶粉的TBST溶液進行封閉，加入一抗，4℃過夜孵育。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，放入室溫條件下孵育，進行顯影，拍照。

1.4 免疫熒光檢測FOXO3a核轉位

將Jurkat細胞用藥，在24孔板中用4%的多聚甲醛固定30 min。PBS洗滌后，用每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100作用10 min，PBS洗滌后每孔加入500 μL DMEM+10% FBS，孵育1 h，PBS洗滌1次，用抗FOXO3a抗體，孵育1 h，再加入稀釋好的熒光標記二抗，封片，拍照。

1.5 細胞轉染

將細胞培養到50%～95%，將siRNA和lipofectmine2000混勻，將DNA-脂質體復合物與細胞混勻，在5%CO2中37℃孵育5 h，轉染24 h后，Western blot鑒定轉染效果。對細胞進行用藥，并檢測細胞活性。

2 結果

2.1 伏立諾他協同NVP-BEZ235誘導Jurkat細胞的凋亡

為檢測伏立諾他及NVP-BEZ235能否誘導Jurkat細胞發生凋亡，利用流式細胞技術測定細胞的凋亡情況。結果發現，加入NVP-BEZ235處理48 h能夠明顯引起細胞凋亡，同時伏立諾他也在一定程度上誘導Jurkat細胞凋亡，但當伏立諾他及NVP-BEZ235聯合用藥，凋亡比例明顯高于NVP-BEZ235組(圖1)，這表明伏立諾他可能協同增加NVP-BEZ235誘導Jurkat細胞凋亡。

圖1 伏立諾他協同NVP-BEZ235誘導Jurkat細胞發生凋亡Fig.1 Jurkat cell apoptosis induced by vorinostat combined with NVP-BEZ235

2.2 伏立諾他協同NVP-BEZ235對核轉錄因子FOXO3a磷酸化的影響

為檢測伏立諾聯合NVP-BEZ235用藥是否影響FOXO3a的活性，檢測了聯合用藥后FOXO3a的磷酸化情況。結果顯示，Jurkat細胞中的FOXO3a有磷酸化，但是NVP-BEZ235或伏立諾他處理能夠抑制FOXO3a磷酸化水平，聯合用藥后，FOXO3a的磷酸化水平進一步降低(圖2)。

圖2 伏立諾他協同NVP-BEZ235抑制FOXO3a磷酸化Fig.2 Phosphorylation of FOXO3a restrained by vorinostat combined with NVP-BEZ235

2.3 伏立諾他協同NVP-BEZ235誘導FOXO3a轉位

進一步研究了伏立諾他協同NVP-BEZ235處理對FOXO3a轉位的影響。實驗結果表明，單獨的NVP-BEZ235或伏立諾他都能增加細胞核中FOXO3a的含量，且兩者聯合用藥后，細胞核中FOXO3a明顯高于單獨組，表明伏立諾他聯合NVP-BEZ235能誘導FOXO3a核轉位(圖3)。

圖3 伏立諾他協同NVP-BEZ235誘導FOXO3a核轉位Fig.3 FOXO3a translocation induced by vorinostat combined with NVP-BEZ235

2.4 伏立諾他和NVP-BEZ235通過FOXO3a增加Bim1表達

使用siRNA將FOXO3a沉默，Western blot檢測結果發現，Bim1表達明顯降低(圖4 A)。利用siRNA抑制Bim1的表達，能逆轉伏立諾他及NVP-BEZ235的抑制效果(圖4B)，證明伏立諾他聯合NVP-BEZ235通過FOXO3a誘導Bim1表達，從而誘導Jurkat細胞發生凋亡。

A：沉默FOXO3a對Bim1表達的影響；B：沉默Bim1對細胞活性的影響，組間比較，*P<0.05圖4 伏立諾他和NVP-BEZ235通過FOXO3a誘導Bim1表達Fig.4 Bim1 expression induced by vorinostat combined with NVP-BEZ235 through FOXO3a

3 討論

伏立諾他是已經批準用于治療T細胞淋巴瘤的一類組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可能的作用機制為增強蛋白的乙酰化，改變染色質狀態，誘導腫瘤細胞分化。NVP-BEZ235主要通過阻斷PI3K的活性來顯著降低mTOR的激活，能夠抑制多種腫瘤細胞，且與硼替佐米及阿霉素等藥物也具有協同效應。本研究證實伏立諾他能夠協同NVP-BEZ23誘導Jurkat細胞的凋亡[4]。

叉頭框蛋白(forkhead box protein，FOX)是參與細胞增殖分化的一類蛋白家族，其中FOXO3a與多種細胞生長增殖的基因表達有關。FOXO3a轉錄調因子的活性主要與磷酸化修飾相關，當FOXO3a發生磷酸化后，由胞核轉移到細胞質中，從而抑制轉錄活性[6]。本研究發現，靜息狀態下的Jurkat細胞中的FOXO3a主要位于細胞漿內，且呈磷酸化狀態，但是加入NVP-BEZ235和伏立諾他處理后，可降低FOXO3a的磷酸化，同時發現細胞核內的FOXO3a含量升高，說明FOXO3a發生了核轉位。

Bim1是Bcl-2家族中的一員，與腫瘤的發展密切相關，抑制Bim1表達，可顯著降低抗腫瘤藥物的殺傷作用。抗腫瘤藥物可以通過Bim1誘導腫瘤細胞的凋亡，干擾了FOXO3a表達后發現，Bim1的表達明顯減少。采用siRNA干擾Bim1的表達，伏立諾他和NVP-BEZ235對細胞的促凋亡效應也明顯減弱，證實FOXO3a/Bim1可能參與了伏立諾他及NVP-BEZ235誘導Jurkat細胞發生凋亡。

伏立諾他和NVP-BEZ235聯合用藥能夠誘導Jurkat細胞凋亡，兩者可激活Jurkat細胞的核轉錄因子FOXO3a，上調促凋亡分子Bim1，從而誘導凋亡。