Ⅰ型膠原及骨膜蛋白在骨質疏松大鼠骨髓基質細胞膜片中的表達研究＊

李麗生 何夢嬌 駱凱 何武兵

當前，我國中老年人骨質疏松問題嚴重，其中以絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMO）最為常見[1]。PMO通常是由于絕經后卵巢功能衰退，雌激素水平下降，從而導致的一種低骨量性疾病，骨脆性增加，在沒有創傷外力作用的情況下亦會發生嚴重骨折，嚴重危害中老年人的身體健康，同時也給社會帶來了一定的經濟負擔。因此，PMO的防治至關重要。在骨質疏松癥（osteoporosis，OP）研究中，細胞療法作為一種全新的治療方法近幾年被廣泛研究，當前的主要研究熱點之一是以間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）為主的細胞療法。與傳統的酶消化法相比，細胞膜片技術（cell sheet technology，CST）可以無創性獲取種子細胞，同時還保留完整的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、細胞間連接及細胞表面相關蛋白[2]。因此，與傳統的組織工程相比，骨髓基質細胞（bone marrow stromal cell，BMSC）膜片在骨和軟骨組織工程中具有良好的應用前景[3]。本研究通過L-抗壞血酸誘導構建不同時間點的PMO大鼠BMSC膜片，并檢測其ECM中的Ⅰ型膠原（collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）及骨膜蛋白（periostin，POSTN）的表達，為骨質疏松狀態下骨組織再生尋找新的途徑與技術，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2017年1月-2018年12月，20只SPF級3月齡雌性未孕SD大鼠，體重250～280 g，由上海SLAC實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0006。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM（美國Hyclone公司），胎牛血清（FBS；澳大利亞Wisent公司），蘇木精、伊紅、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松（美國Sigma公司）；成脂誘導分化試劑盒（中國 Cyagen 生物），Trizol Reagent（美國 Invitrogen公 司 ）；SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）（日本Takara公司），兔抗大鼠Col-Ⅰ多克隆抗體、兔抗大鼠POSTN多克隆抗體（美國Abcam公司），Masson三色染色試劑盒、即用型免疫組化EliVisionTM plus試劑盒、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司），HRP標記的羊抗兔二抗IgG（中國Biosharp公司）；倒置熒光顯微鏡（IX-71，日本Olympus公司）；實時熒光定量PCR儀（LightCycler480，瑞士Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 PMO大鼠BMSCs的體外分離培養 采用去勢法建立骨質疏松大鼠模型，術后12周體外分離培養PMO大鼠BMSCs。腹腔注射麻醉下取出大鼠下肢管狀長骨，反復沖洗收集骨髓腔沖洗液，室溫下 1 000 r/min 離心 5 min，DMEM 低糖培養液（含10% FBS、青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml）重懸并吹打混勻、常規培養。

1.2.2 PMO大鼠BMSCs的鑒定 原代BMSCs細胞懸液接種于培養皿，12 d后進行結晶紫染色，并進行細胞克隆計數、拍照。第3代BMSCs按5×104/個孔接種于12孔板，待細胞融合至70%～80%時，分別更換為成骨誘導液及成脂誘導液。成骨誘導7 d后進行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，21 d后采用茜素紅染色（alizarin red，AR）觀察礦化結節；成脂誘導21 d后成脂誘導組采用油紅O染色觀察脂滴。

1.2.3 PMO大鼠BMSC膜片的體外構建 第3代BMSCs按5×104/孔密度接種于12孔板，待細胞融合至 70%～80% 時，更換為含 50 μg/ml L- 抗壞血酸的培養液，每3天更換培養液，誘導10 d形成細胞膜片。

1.2.4 PMO大鼠BMSC膜片的組織學觀察 L-抗壞血酸連續誘導培養5、10 d刮取細胞膜片。固定，常規脫水，透明，浸蠟，包埋，連續切片，備用。蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及Masson染色觀察5、10 d的細胞膜片結構，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ及POSTN基因表達檢測 第3代BMSCs按5×104/孔密度接種于12孔板，待細胞融合至70%～80%時，更換為含50 μg/ml L-抗壞血酸的培養液，分別于誘導的第5、10天按試劑盒說明書提取兩組細胞的總RNA，檢測RNA濃度及純度，按試劑盒說明書進行逆轉錄，實時熒光定量PCR法檢測Col-Ⅰ和POSTN的表達，用2-ΔΔCT方法計算相對表達量。引物序列，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ及POSTN蛋白表達檢測 石蠟切片常規脫蠟和水化，滴加3%過氧化氫后，滴加兔抗鼠Col-Ⅰ（1∶500）、兔抗鼠POSTN（1∶900），陰性對照組加 PBS，4 ℃濕盒內孵育過夜，辣根酶標記抗兔IgG聚合物試劑37 ℃孵育20 min，DAB顯色、蘇木素復染、脫水，透明、中性樹膠封固。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PMO大鼠BMSCs的體外分離培養

原代培養（P0）3 d，顯微鏡下可見光亮的圓形細胞下散在的少量梭形細胞貼壁，見圖1A；P0培養7 d，梭形細胞快速生長，纖維集落樣排列；P0培養12～14 d，相鄰集落達到80%融合并進行傳代，見圖1B。傳代培養后第三代（P3）細胞增殖加速，形狀為多角形或梭形，見圖1C。

2.2 PMO大鼠BMSCs的鑒定

第1代細胞接種培養12 d左右，結晶紫染色后，肉眼觀察到紫色克隆集落，顯微鏡下見單細胞形成的克隆呈集落生長，見圖2A、B。成骨誘導第7天，ALP染色后胞質內見深藍色物質（不溶性），見圖2C。成骨誘導第21天，AR染色可見紅染的礦化結節大小不一，見圖2D。成脂誘導第21天，空泡樣脂滴采用油紅O染色后被染成橘紅色，見圖2E。

2.3 PMO大鼠BMSC膜片的大體觀察

經L-抗壞血酸連續誘導10 d左右，細胞膜片的邊緣開始皺縮卷曲，孔板底部可見一乳白色半透明的膜狀結構，見圖3A；從卷曲處小心刮起，漂浮于PBS中，見圖3B；完整刮起后細胞膜片明顯收縮，色呈乳白色，微薄磨玻璃樣半透明結構，見圖3C，可塑性較強。

2.4 PMO大鼠BMSC膜片的組織學觀察

細胞膜片HE染色結果顯示，第10天形成的細胞膜片厚度增加，細胞層數增多，ECM厚度也由第5天的20 μm左右增厚至50 μm左右。Masson染色結果顯示，隨著誘導時間增加，細胞間藍色膠原纖維明顯增多，見圖4。

2.5 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ及POSTN基因表達檢測

誘導第10天細胞膜片的ECM相關基因Col-Ⅰ及POSTN mRNA相對表達量均高于第5天，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ、POSTN mRNA相對表達量比較（±s）

表2 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ、POSTN mRNA相對表達量比較（±s）

注：qPCR實驗中，采用5只骨質疏松大鼠，每只大鼠分離培養的BMSCs分別誘導形成5 d細胞膜片組、10 d細胞膜片組，兩分組各得到5組數據進行分析。

組別 Col-ⅠmRNA相對表達量POSTN mRNA相對表達量第5天細胞膜片組（n=5） 1.04±0.36 0.98±0.08第10天細胞膜片組（n=5） 1.81±0.26 2.07±0.08 t值 5.100 15.971 P值 0.007 ＜0.001

2.6 PMO大鼠BMSC細胞膜片Col-Ⅰ及POSTN蛋白表達檢測

免疫組織化學染色結果顯示，第5天左右刮取的細胞膜片厚度較薄，但仍有表達Col-Ⅰ和POSTN。而誘導第10天刮取的細胞膜片，與第5天組相比，強表達ECM相關蛋白Col-Ⅰ和POSTN，并且厚度增厚，連續性較為完整，見圖5。

3 討論

OP是由諸多病因引起的以骨密度及骨量減少、骨小梁結構破壞為特征的骨代謝疾病，常引起橈骨遠端、肱骨近端、脊椎體、股骨頸骨折，嚴重影響中老年人，特別是中老年絕經后女性的生活質量[4]。PMO主要是由絕經后雌激素缺乏引起的骨代謝失調，破骨細胞的骨吸收大于成骨細胞的骨形成作用。目前，PMO治療多采用抗骨吸收藥物（如雙磷酸鹽）和促進鈣鹽沉積（如鮭魚降鈣素）改善和緩解PMO的癥狀，但藥物的不良反應（如胃腸道、心血管方面的副作用）和其本身并不能促進骨量再生的局限性限制了其在臨床上的應用[5]。因此尋找PMO治療的新方法，促進骨組織再生成為當前研究熱點之一。

MSCs具有自我增殖、多向分化能力，已有相關研究證實其與OP的進展密切相關。近幾十年來，MSCs廣泛應用于再生醫學研究中，為骨和關節疾病的治療提供新的方法和思路。MSCs在OP治療中應用前景廣泛。伴隨機體的衰老，人體中的BMSCs含量降低，成脂分化大于成骨分化，加速OP的進展[6]。多項研究表明，BMSCs移植可能是預防或治療雌激素缺乏和老年性骨質疏松癥的可行方法[7-9]。本研究獲取的PMO大鼠BMSCs具有增殖、克隆形成及成骨、成脂分化能力，可作為種子細胞應用于后續的研究中。

細胞膜片是一種富含ECM的細胞片狀聚集，保留了內源性ECM、受體和黏附蛋白，增強了細胞的活力和交流，允許自發地黏附到生物材料和生物表面[10]。當前，構建細胞膜片的方法有：溫度反應系統、磁反應系統、機械系統、光反應系統等[2]。其中，溫度反應系統和機械系統是骨和軟骨再生中制備細胞膜片應用最廣泛的方法。機械系統通過添加 L-抗壞血酸刺激細胞分泌大量的ECM，連續培養從而形成細胞膜片，是制備細胞膜片最簡單的方法[11]。在骨和軟骨組織工程中，BMSC細胞膜片被廣泛研究，表現出良好的應用前景。Ma等[12]將機械法制備的兔BMSC細胞膜片移植到裸鼠皮下，結果顯示BMSC細胞膜片無須支架材料也具有異位成骨的潛能。隨著研究的深入，研究者發現機械法制備成骨誘導后的BMSC細胞膜片可促進骨缺損部位的骨再生[13]。骨折愈合包括最初的炎癥反應，隨后的骨痂形成以及最后的骨骼改建，最終恢復骨的結構與功能。然而，在某些情況下，由于復雜的因素，如生物或機械環境的破壞，可能會出現骨質生長緩慢乃至不生長的情況。一系列研究表明BMSC成骨誘導細胞膜片可增強骨折部位的骨形成，改善骨愈合延遲，并形成穩定的新生骨[14-15]。此外，由于細胞膜片可操作性不佳，無法起到骨支撐作用，因此，可以通過在支架材料上復合細胞膜片來修復骨缺損，發揮各自的優勢。BMSC細胞膜片包裹多孔的磷酸三鈣β-TCP/Col-Ⅰ復合支架，經過成骨誘導后植入裸鼠體內，表現出良好的成骨能力[16]。除了β-TCP支架外，聚（癸二?；视王ィ≒SeD）及聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）復合細胞膜片亦可促進骨缺損部位的骨再生[17-18]。

目前細胞膜片技術在骨質疏松狀態下骨組織修復與再生的相關研究較少，本研究采用機械系統制備PMO大鼠BMSC細胞膜片，無須特定的培養基質或技術，連續誘導10 d左右即可用細胞刮刀刮取完整的細胞膜片，所獲得的細胞膜片可塑性良好。HE、Masson染色結果提示誘導時間延長，細胞膜片中細胞層數增加，ECM增多，膜片增厚。

ECM是一種動態變化的微環境，是由細胞分泌到細胞外間質中的大分子所構成的非細胞三維結構，在為細胞提供結構支持及附著位點和調節細胞的生物學功能中均有優勢，參與組織的修復和再生。膠原蛋白是ECM的主要結構成分，其中最豐富的膠原蛋白類型是Ⅰ型，Col-Ⅰ是皮膚、骨骼運動系統相關組織完整性的主要構架成分，同時參與細胞增殖、分化、信號傳遞等功能[19]。POSTN是一種分泌型細胞外基質蛋白，通過胞膜受體調節細胞黏附、增殖及分化，參與ECM組裝。POSTN調節ECM的交聯和穩定，包括膠原蛋白的纖維化，為細胞外基質蛋白（Col-Ⅰ、纖維連接蛋白、腱糖蛋白-C和層粘連蛋白γ2）和輔助蛋白（骨形成蛋白-1和CCN3）的組裝提供支架，是ECM復雜結構的基礎[20]。POSTN可通過NF-κB信號通路調節Cbfa-1和RANKL表達，調節骨代謝平衡[21]。本研究從基因及蛋白水平檢測PMO大鼠BMSC膜片不同時間點Col-Ⅰ、POSTN的分泌情況，結果提示骨質疏松狀態下的BMSCs仍然具有較強的細胞功能，保留的分泌ECM能力使形成的細胞膜片可塑性較強，生物學功能穩定，自身分泌的ECM是骨組織再生和修復的結構基礎和天然支架，為自體移植促進骨質疏松狀態下骨組織再生提供實驗依據。

綜上所述，本研究構建的PMO大鼠BMSC細胞膜片可保留自身分泌的ECM，為后續自體移植細胞膜片實現骨質疏松狀態下骨組織再生提供幫助，但是其物理性能、體內成骨能力及骨再生作用機制有待后續實驗探討。