白楊素衍生物的抗氧化和抗炎活性研究進展

凡春玲，申棟帥，馮小明，肖 攀，陸 璐，王紅義，牛廷獻

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院，蘭州 730050)

白楊素化學名稱為5,7二羥基總黃酮(chrysin)，化學結構如圖1所示，來源于木蝴蝶、山白松和芒松等植物，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗高血壓、抗菌等廣泛藥理活性, 但因其不溶于水、生物利用度低、口服給藥會產生嚴重的“首過效應”等原因不能用于臨床[1]，因此成為了通過結構修飾來進行新藥開發研究中的一個非常重要的原料。

圖1 白楊素的結構

新的白楊素衍生物合成后主要被用于抗癌或抗腫瘤活性篩選，而對其它藥理活性的研究較少，但白楊素之所以具有眾多的藥理活性與其抗炎和抗氧化作用有著非常緊密的聯系[2]。炎癥和氧化應激是包括癌癥在內的眾多疾病產生的誘因或并發癥，因此能夠顯著地抑制體內的炎癥或氧化應激過程的藥物，理論上可以對其它疾病產生一定的藥效，阿司匹林等非甾體類抗炎藥物往往具有眾多藥理作用的原因就在于此[3-4]?；谀壳鞍讞钏氐难苌飻盗勘姸啵瑔蝹€衍生物已驗證的藥理活性較少，以及炎癥和氧化應激在疾病發生發展過程中的重要地位，本文將主要對已驗證具有明顯抗炎或抗氧化活性的白楊素衍生物進行綜述，通過對它們的化學結構進行展示，結合該化合物的藥效研究結果，促進研究人員對白楊素可進行的結構修飾方向的了解，以及不同結構修飾后的化合物是否具有良好藥理活性的前景分析。綜上所述，希望本文對基于白楊素或白楊素衍生物結構基礎上的新獸藥研發提供思路和信息支持。

1 抗氧化活性

1.1 抗氧化損傷 李紅俠等合成了一種新型白楊素衍生物(CD，結構如圖2所示)，并分別以人正常肝細胞株(L-O2細胞)和昆明小鼠為實驗對象來研究CD的抗氧化活性。使用雙氧水(H2O2)誘導L-O2細胞氧化損傷模型，結果表明經該衍生物處理后，L-O2細胞中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著升高，丙二醛(MDA)的含量明顯降低。此外使用小鼠進行體內實驗，模型組通過雙氧水誘導小鼠氧化損傷，同時設置CD注射給藥組(5 mg·kg-1)，最終檢測小鼠血液和肝臟組織中GSH-Px、SOD、CAT的活性及MDA含量。結果表明與模型組相比，當小鼠給藥濃度為5 mg·kg-1時，小鼠血液中MDA含量相比模型組下降47.01%，GSH-Px、CAT和SOD活性分別升高了108.41%, 74.29%和54.00%。小鼠肝臟組織中MDA含量下降了54.00%，GSH-Px、CAT和SOD活力則分別增加了44.91%，55.21%和45.17%，上述結果說明CD具有明顯的抗氧化活性[5]。

圖2 CD的結構

Zhu等合成了白楊素-β-D-半乳糖苷(結構如圖3所示)，通過紫外燈誘導氧化損傷模型，并對其進行氧化損傷相關指標評價。結果表明白楊素-β-D-半乳糖苷的氧自由基清除能力強于白楊素。在無紫外光照射下，白楊素-β-D-半乳糖苷的超氧陰離子清除率是32.79%，相比白楊素升高15%。而在紫外線燈照射下，白楊素-β-D-半乳糖苷的超氧陰離子清除率達到了60%，遠超此時白楊素的清除率[6]。

圖3 白楊素-β-D-半乳糖苷的結構

Rahul V等將白楊素和不同的哌嗪、吡啶、嗎啉環進行偶聯，得到了7a-7w共計23種化合物，主要結構如圖4所示，區別在于R取代基不同。進行了DPPH抗氧化試驗和ABTS氧自由基清除實驗，結果表明這23種化合物在這兩種實驗中的IC50范圍分別是20.30～34.06 μg/mL和5.569～8.971 μg/mL，整體表現出較強的抗氧化損傷的活性，其中7f, 7j, 7k, 7l, 7n, 7q, 7v和7w的抗氧化損傷的活性最強[7]。Veronika等則是將類胡蘿卜素與不同的黃酮類物質進行偶聯，并進行抗氧化活性篩選。合成的5種偶聯物(結構如圖5所示)，通過Trolox等效抗氧化能力(TEAC)試驗評價其抗氧化活性。結果表明，23號胡蘿卜素白楊素偶聯物具有極強的抗氧化活性，其余4種同樣具有抗氧化活性，但遠遠弱于23號偶聯物[8]。Liu等合成了7種白楊素衍生物(結構如圖6所示)，并篩選了它們的抗菌和抗氧化活性。采用DPPH自由基清除實驗和β-胡蘿卜素漂白法兩種方法進行抗氧化活性的測定，具體結果如表1所示。結果表明，7種化合物都具有良好的抗氧化活性，其中4號化合物的抗氧化效果最好，且優于陽性對照藥物二丁基羥基甲苯(BHT)[9]。

圖4 Rabul V等所合成的23種白楊素衍生物主要結構

圖5 VeronikaV等合成的5種白楊素與胡蘿卜素偶聯物(22-25)的結構

圖6 Liu等所合成的7種白楊素衍生物結構

表1 Liu等所合成的七種白楊素衍生物的抗氧化活性測試

Navarro等提取了葉下珠屬植物葉子中的酚類物質，共得到20種化合物。其中的8種類黃酮類物質中有1種為白楊素衍生物，結構如圖7所示。這些衍生物混合在一起進行了抗氧化活性測試，在DPPH自由基清除實驗中，混合物的IC50為0.15 ± 0.01，遠低于爵床質素B(14.28 ± 0.30)和抗環血酸(3.74 ± 0.05)。氧化自由基吸收能力(ORAC)試驗測得的混合物抗氧化能力指數為(2.76±0.05)，比爵床質素B(0.95±0.02)和抗壞血酸(1.62±0.07)明顯增高[10]。楊芽黃素是天然黃酮類物質，與白楊素結構極其相似，結構如圖8所示。Bian等在研究二芳基庚烷的抗氧化活性時，同樣對楊芽黃素的抗氧化活性進行了DPPH測試。結果表明，楊芽黃素的IC50大于1000 μg/ml，即抗氧化活性較差，并分析可能與7號位羥基缺失有關[11]。

圖7 Navarro等所提取得到的白楊素衍生物結構

圖8 楊芽黃素的結構

1.2 抗缺氧 機體在缺氧狀態下，會有大量的氧自由基產生，繼而誘發脂質過氧化，最終導致機體的氧化損傷[12]。研究高原缺氧疾病的相關學者對白楊素進行結構修飾，以期能夠用作治療高原缺氧的藥物。如圖9所示，為了提高白楊素的水溶性，范小飛等合成了4種新型的三氮唑白楊素衍生物。通過建立小鼠缺氧模型，對這4種衍生物進行抗缺氧活性檢測，證實這4種化合物均能延長小鼠的存活時間，其中1b和4b組小鼠的存活時間最高，分別為(42. 71±4. 89)和(40. 49±3. 59)min，甚至高于陽性藥乙酰唑胺組的(36. 60±3.84)min[13]。

圖9 范小飛等合成的4種三氮唑白楊素衍生物的結構

景臨林等以白楊素為原料，先后合成了HPN和HEPN兩種化合物，結構如圖10所示，并先后驗證了兩個化合物對低氧狀況下小鼠心臟氧化損傷的保護作用。結果表明，HPN和HEPN均可以明顯升高缺氧小鼠的心臟組織中的SOD, CAT和GSH-Px的活性，降低活性氧(ROS)和MDA的含量。此外，兩個化合物能夠增加Nrf-1和OH-1的表達，進而維持了ATP酶的活性。此外，兩個衍生物顯著降低Caspase-3, Bax和Bcl-2的表達量及Bax/Bcl-2的比例[14]。此外，HPN在PC12細胞中以及HEPN在腦缺血大鼠中的抗氧化作用同樣得到了證實[15-16]。同樣以白楊素為先導化合物，陳莉莉設計合成了6種化合物，結構如圖11所示?？谷毖鯇嶒灲Y果表明這些化合物均可以明顯延長缺氧小鼠的存活時間、斷頭后小鼠的喘息時間以及亞硝酸鈉中毒小鼠的存活時間，這證實了此6種化合物的抗缺氧作用，其中化合物a的抗缺氧效果最好[17]。

圖10 HPN和HEPN的結構

圖11 白楊素羥甲基化衍生物的結構

1.3 抗癌 Leon等合成了白楊素和釩的復合物(VOchrys)，結構如圖12所示，證明了該化合物在MG-63人骨肉瘤細胞模型中的抗癌活性與在該細胞中抗氧化應激活性有著緊密聯系[18]。上述Rahul V等合成的23種化合物除進行抗氧化活性篩選外，同樣進行了抗癌活性篩選。結果與抗氧化結果相似，大部分化合物均表現出抗癌活性，其中7H, 7j, 7L和7O四種化合物抗癌活性最顯著[7]。Monika等合成了白楊素衍生物5-羥基-7-甲氧基黃酮(HMF)，結構如圖13所示。ROS是內質網應激誘導的關鍵介質，可導致細胞內ca2+釋放、JNK磷酸化和線粒體凋亡通路的激活。HMF處理人結腸癌細胞(HCT-116細胞)導致線粒體和細胞質ROS生成增加，抗氧化酶表達減少。在HMF處理后，IRE1-α的表達和JNK的磷酸化有明顯的上調，ROS大量產生，從而調控線粒體介導的凋亡信號通路，上述結果表明HMF是一種可以通過促進癌細胞的氧化損傷繼而治療結腸癌的前景光明的藥物[19]。

圖12 VOchrys的結構

圖13 HMF的結構

2 抗炎活性

2.1 抑制環氧化酶和抗癌 花生四烯酸的代謝過程可以產生多種具有生物活性物質，如前列腺素E2(PGE2)和血栓烷素A2(TXA2)等，這些產物廣泛參與了機體的多種生理活動。環氧化酶(COX)是花生四烯酸(AA)代謝過程中的關鍵限速酶，對COX的影響可以間接控制花生四烯酸代謝產物的產生，繼而調節機體多種生理過程。COX主要包括兩種亞型，即COX-1和COX-2，COX-1主要為結構型酶，在多種組織或細胞中表達量恒定；而COX-2主要為誘導型酶，在正常組織中無表達或微量表達，而當細胞受到病理刺激時，COX-2的表達急劇上升，此現象通常被認為是COX-2對促炎介質的快速應答，即其在炎癥發生的病理過程中扮演著重要角色[20]。而當前研究進一步證實對腫瘤細胞中COX-2的抑制作用，可以對腫瘤細胞產生生長抑制和凋亡[21]。

Singh 等將白楊素與吲哚或吡唑等結構進行拼合，構建了多種新型的白楊素雜合衍生物，結構如圖14和表2所示。大部分雜合物能夠選擇性地抑制COX-2的活性，化合物23對COX-2和COX-1的IC50值分別為0.7和118 μmol/L，證明對兩者的選擇性明顯；而對照藥物吲哚美辛對COX-2和COX-1的IC50值分別為0.96和0.08 μmol/L，選擇性遠低于合成的衍生物。分子對接研究再次證明，化合物23能夠對接到COX-2的活性位點，而不能與COX-1的活性位點結合[22]。Heeyeong等以白楊素為原料合成了4種衍生物，其中Ch-2和Ch-4對脂多糖誘導的小鼠Raw264.7巨噬細胞有著顯著地抑制作用，而僅僅只有Ch-4能夠顯著抑制COX-2的活性，相比COX-1，其對COX-2有著明顯的選擇性。Ch-4對iNOS無明顯作用，而Ch-2對iNOS有著微弱的抑制作用[23]。

圖14 Ch-12～Ch-5的結構

表2 Ch-2～Ch-5的R1和R2取代基

Lim等在其實驗室前期合成的白楊素衍生物Wogonin的結構基礎上，最新合成了白楊素衍生物C-721，Wogonin和C-721的結構如圖15所示。Wogonin已經被證實能夠抑制小鼠RAW 264.7巨噬細胞中COX-2和iNOS的活性[24]，因此Lim等對C-721在小鼠RAW 264.7巨噬細胞中的抗氧化活性進行了檢測。在脂多糖誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型中，C-721可以顯著抑制COX-2酶的活性，繼而降低前列腺素E2的含量；通過降低iNOS的活性，一氧化氮的含量隨之降低；降低TNF- α和IL-6的產生[25]。

圖15 C-721和Wogonin的結構

2.2 抗血小板活化和聚集 當血小板活化后，便啟動了血小板內部的花生四烯酸代謝過程，代謝產物TXA2可以顯著誘導血小板的進一步活化和聚集，是血小板活化過程中信號放大的關鍵因素[26]。如上文所說，炎癥過程中COX-2大量表達，通過抑制COX-2的活性，就可以減少TXA2的產生，進而抑制了血小板的活化過程。為了進一步提高白楊素的抗血小板聚集活性，Ravishankar等合成了白楊素-釕配合物(29)和硫代白楊素-釕配合物(30)，結構如圖16所示，這些衍生物的生物利用度和細胞通透性相比白楊素均增加。與白楊素相比，化合物29顯示出4倍于白楊素的抗血小板聚集活性，而化合物30的活性稍弱。纖維蛋白結合試驗表明，兩種化合物均能抑制血小板通過纖維蛋白進行結合，即它們能夠顯著抑制整合素αⅡbβ3通路[27]。

2.3 抗結腸炎、皮膚炎、關節炎 Song等通過γ輻射得到了羥乙基化的白楊素，結構如圖17所示。在體外，通過脂多糖刺激來提高骨髓來源樹突狀細胞(BMDC)的氧化應激水平，與羥乙基白楊素或白楊素孵育后，細胞中促炎細胞因子水平、表面分子水平、抗原呈遞能力和T細胞增殖/活化的水平均降低，相比白楊素，該衍生物抑制BMDC細胞成熟的效果更加明顯。此外，羥乙基白楊素可以調控絲裂原活化蛋白激酶和核因子-κB蛋白的表達量。對小鼠灌胃8天，模型組給予脂多糖和生理鹽水的混合物來誘導結腸炎模型，給藥組給予脂多糖和羥乙基白楊素的混合物，結果表明羥乙基白楊素給藥組結腸炎相關的炎癥指標結果明顯降低[28]。

圖17 Song等合成的羥乙基白楊素的結構

圖18 CPD 6的結構

Yu等以白楊素為原料，合成了9種化合物，并主要對化合物6(CPD6)進行抗炎活性測試。在脂多糖誘導的巨噬細胞氧化損傷模型中，CPD6能夠顯著抑制一氧化氮等炎癥因子，對一氧化氮的半數有效濃度為3.613 μM。在培養的角質細胞中，CPD6同樣顯著抑制了炎癥細胞因子的釋放，以及NF κ B和JAK2/STAT1 信號通路，并激活Nrf2 / HO-1信號途徑。在小鼠急性和慢性皮膚炎模型中，CPD6對上述指標有著明顯的抑制作用[29]。Kim對C-721同樣進行了體內實驗，口服和腹腔注射10 - 100 mg·kg-1時，對角叉菜膠誘導的小鼠足腫脹模型分別有25.2%和44.3%的抑制作用。此外，當小鼠腹腔注射50 mg·kg-1, 3 次/周時，該化合物對膠原誘導的關節炎有顯著的抑制作用[25]。

2.4 抗癌 Byun等合成了白楊素衍生物CM1，結構如圖19所示，為研究其抗癌活性及機制，使用脂多糖(LPS)誘導形成RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型。LPS刺激后，巨噬細胞內釋放出大量的促炎介質，細胞因子TNF-α和IL-6以及一氧化氮(NO)含量明顯上升，絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)和NF-κB信號通路被激活，而CM1可以顯著降低這些炎癥指標。此外，CM1能夠劑量和時間依賴性地提高Toll樣蛋白相互作用蛋白(Tollip)的表達，通過流式檢測發現細胞表面分子(CD80、CD86和MHC)的表達顯著降低，TNF-α和IL-6含量以及COX-2與iNOS蛋白表達量顯著降低，上述結果說明CM1具有良好的抗炎活性，并因此具有潛在的抗腫瘤活性[30]。Byun等另外合成了白楊素衍生物CM2，結構如圖19所示，在二硝基氯苯誘導的小鼠皮膚炎模型中，炎癥因子IL-5、IL-4、IFN-γ和IL-17被CM2顯著抑制。此外在巨噬細胞中，CM2能夠明顯抑制Lps誘導的IL-6等炎癥因子的分泌。CM1對巨噬細胞存在一定的毒性作用，而CM2對巨噬細胞無明顯毒性損傷，因此CM2更具備開發價值[31]。

圖19 CM1和CM2的結構

Mahaboob等合成了二甲氧基黃酮(dimethxy flavone, DMF)，結構如圖20所示。該衍生物在早期肝癌大鼠模型中顯著抑制n -亞硝基二乙胺(DEN)誘導的大鼠腫瘤前病變的發生，機制在于DMF對DEN誘導的腫瘤前結節中炎癥介導的Wnt通路、NF-kB通路以及凋亡相關基因含量有顯著影響。相比于對照組，DEN處理組COX-2和iNOS明顯增加，p53、caspase-3和bax等凋亡介導因子明顯減少。DMF (100 mg·kg-1)組可抑制肝結節發生率和多發率分別達82%和78%，DMF還逆轉了NF-kB和Wnt通路的激活和蛋白的表達降低。本研究的結果表明，DMF的化學預防作用可能與Wnt通路的衰減和NF-kB與COX-2介導的炎癥反應的抑制有關[32]。

圖20 二甲氧基黃酮的結構

3 展 望

新獸藥研發過程具有周期長、前期化合物合成與篩選過程工作量大、耗費資金量大等特點，因此，如能以某一具有良好藥理活性的化合物為基礎，進行結構改造，則可以大大簡化研發難度，并提高研發成功率。白楊素就是這樣一個良好的結構母體，其擁有廣泛的藥理作用，但受困于不溶于水、生物利用度低、口服給藥會產生嚴重的“首過效應”等原因無法繼續開發?？蒲腥藛T對白楊素進行了多種結構修飾的嘗試，主要包括磺化、硝化、烷基化、酯化、磷?；?，以期在保留白楊素廣泛的藥理活性的同時，獲得更好的實用價值。關于白楊素衍生物的報道日益增多，已經合成且已經完成活性初篩的化合物眾多，但新獸藥研發領域未見有研究團隊涉足白楊素衍生物的研發。針對人藥禁止獸用的現狀，新獸藥研發過程更顯重要，而白楊素具有多種藥理活性，合成產生的白楊素衍生物可進行多方面的活性篩選，有希望在多個藥理活性方向上有所收獲。如前文所述，所列出的白楊素衍生物具有良好的抗炎或抗氧化活性，部分化合物同時具有抗癌或抗血小板聚集活性，可基于這些衍生物的結構進行寵物抗炎、抗血小板聚集或抗癌藥的開發。其中表一所示的4號化合物抗氧化效果最好，CM2(結構如圖19所示)抗炎效果非常顯著，ch-4(結構如圖14和表2所示)可以選擇性抑制環氧化酶的COX-2亞型，在表現出較強的抗炎活性的同時還具有抗癌和抗血小板聚集活性，基于上述三個衍生物的結構改造值得重點關注。此外，白楊素除了本文所介紹的抗氧化和抗炎活性之外，還具有良好的抗菌活性。針對嚴峻的細菌耐藥性現狀，以白楊素為母體的抗菌藥物研發同樣具有可能性。

白楊素藥理活性眾多，其改造后的衍生物是否同樣具有廣泛的藥理活性值得驗證，而目前存在的主要問題是許多已表明某方面明顯藥理活性的水楊素衍生物，卻沒有對其它藥理活性的研究。這主要表現在大多數白楊素衍生物均會進行抗癌或抗腫瘤活性篩選，卻忽略了其它的藥理活性的驗證，無顯著抗癌或抗腫瘤活性的化合物可能是擁有其它藥理活性的良藥?；谘装Y和氧化應激在機體疾病發生發展歷程中的重要作用，本文對具有抗炎和抗氧化作用的白楊素衍生物進行綜述，同時也倡導科研人員將合成的白楊素衍生物除了抗癌活性篩選外，也對其抗炎、抗氧化活性進行篩選，進一步判斷新化合物是否具有廣泛的藥理活性。本文通過對相關白楊素衍生物的化學結構進行展示，在此衷心希望通過本文能引起獸藥研發人員對白楊素或白楊素衍生物的重視，一定程度上促進基于白楊素或白楊素衍生物的獸藥研發過程，愿本文能對這一過程提供思路和信息支持，最后祝愿通過對白楊素或白楊素衍生物的結構修飾，能夠開發得到用于獸醫臨床的專屬新獸藥。