氣相色譜法檢測多西環素中乙醇含量的不確定度評定

季 璇，王 軒，戴 青，趙 暉，韓寧寧，楊秀玉

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

鹽酸多西環素是由土霉素的α-6位脫氧得到的一種半合成四環素類抗生素，主要用于防治敏感細菌所致的畜禽呼吸道、膽道、尿道和皮膚軟組織感染，是一種在臨床上被廣泛使用的長效廣譜抗生素類藥。多西環素原料藥制備的最后一步使用的是氯化氫-無水乙醇置換，因此成品中含有部分殘留的乙醇[1-2]。乙醇殘留量必須嚴格控制，否則將直接影響多西環素原料藥的質量，因此，各國藥典中的多西環素質量標準都對其中乙醇的含量進行了控制。氣相色譜內標法是《中國獸藥典》2020年版規定的測定多西環素中乙醇含量的方法，內標法是氣相色譜定量分析中的一種重要技術，是一種比較準確的定量方法；在色譜柱不超載的情況下，內標法的定量結果與儀器進樣量重復性無關，因此，相對來說，內標法保證了測定結果的準確性[3]。在獸藥檢測領域中，實驗環境、實驗過程中用到的量具、實驗儀器和人員等都會對檢測結果產生影響，導致檢測結果產生一定的誤差，所得的測量值只能為該檢驗條件下的一個最佳估計值。因此，如何能表達出更加準確或有效的結果，得出更加科學可靠的結論對獸藥檢測工作者來說至關重要。測量不確定度是被用來表征被測量值分散性的參數，是對測量結果可能誤差的度量，用來定量表示測量結果的可信程度[4-5]。一個完整的測量結果，除了應給出被測量的最佳估計值之外，還應同時給出測量結果的不確定度[6]。目前廣泛通用的不確定度評定模型是《測量不確定度評估指南》中的模型，根據《JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示》[7]，本文采用氣相色譜法對多西環素中乙醇的含量進行了測定，并對測定過程的不確定度進行了分析和評估，可為檢測方法的優化和檢驗結論的科學判定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與材料

1.1.1 試藥 供試品(鹽酸多西環素)，批號為A202108132，某市售商品；對照品(乙醇)，含量為100.0%，批號為130106-202105，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 材料 容量瓶：10 mL、50 mL和100 mL，A級；移液管：5 mL，A級。

1.2 儀器設備 氣相色譜儀：Agilent7890A氣相色譜儀，配有FID檢測器，美國安捷倫科技公司；電子天平：型號XS205Du，分度值0.1 mg，Mettler Toledo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 內標溶液 取正丙醇約0.5 g，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.2 供試品溶液 取供試品約1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加內標溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.3 對照品溶液 取乙醇對照品約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加內標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.4 系統適用性溶液 取乙醇對照品約5 g，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取2、5、3 mL，分別置25、50、25 mL量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度制成每1 mL中含乙醇4、5、6 mg的系統適用性溶液，分別相當于對照品溶液的80%、100%和120%。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：HP-PLOT/U，30 m×0.53 mm×1 mm/USB346822H；柱溫：135 ℃；進樣口溫度：150 ℃；檢測器溫度：180 ℃；載氣：氮氣，流速：3 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1。

2 結果與分析

2.1 乙醇含量的測定

2.1.1 校正因子的計算 取對照品溶液，照1.3.2項的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算校正因子，結果見表1。

表1 校正因子結果表

2.1.2 多西環素中乙醇的含量 取供試品溶液，照1.3.2項的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按內標法計算多西環素中乙醇的含量，結果見表2。本實驗多西環素中乙醇含量的測定結果為5.0%。

表2 乙醇含量測定結果表

從數學模型中可知X和W、V是相互獨立的非線性關系，可根據JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》中的要求計算相對合成不確定度，無需計算各標準不確定度分量的靈敏系數。

2.1.4 不確定分量的分析與計算 本實驗測量不確定度來源的分析受檢測過程數學模型中各參數的影響，多西環素乙醇含量的不確定度來源主要來自稱量，溶液配制和儀器測量等其他因素，因果分析圖見圖1。

圖1 乙醇含量測定不確定因素因果圖

2.2 測量不確定度評定

2.2.2 溶液制備過程的不確定度分析 溶液制備過程的不確定度主要來源于校準的容量瓶內部體積u(V1)、容量瓶讀數重復性u(V2)和容量瓶實際溶解時的溫度和校準溫度的偏離程度u(V3)3個方面。

表3 100 mL容量瓶的重復測量結果

表4 10 mL容量瓶的重復測量結果

2.2.2.3 內標引入的不確定度分析 加入內標的標準不確定度主要來自于內標物的稱量、稀釋定容和實驗溫度與校正溫度的差異3方面的因素，本實驗中的供試品溶液和對照品溶液用的是同一內標溶液溶解稀釋，所以內標物的稱量和稀釋定容在計算中能夠相互抵消，因此，本實驗中內標引入的不確定度忽略不計。

2.2.2.4 系統適用性溶液的不確定度分析 系統適用性試驗溶液僅用來評價色譜系統連續進樣的重復性能，不參與最終乙醇含量的計算，因此，本實驗不考慮系統適用性溶液引入的不確定度。

表5 重復性測量結果

2.3 合成不確定度的計算 u(X)合成標準不確定度即不確定分量的總方差的正平方根[10]，根據本實驗各分量相對標準不確定度(表6)，則合成標準不確定度ur(X)計算如下：u(X)

表6 分量的相對標準不確定度表

2.4 擴展不確定度的計算 擴展不確定度為合成標準不確定度和擴展因子(k)的乘積，U=u(X)·k=0.03%×2=0.06%(k=2，置信區間為95%)，含量可由測定值±擴展不確定度表示[7]，因此多西環素中乙醇含量的結果可表示為(5±0.06)%，k=2。

3 討論與結論

測量不確定度的計算是將可能代入不確定度的實驗環節作為分量，再將分量的相對標準不確定度合成所得。分量的相對標準不確定度能夠將各個檢驗步驟對檢驗結果的影響程度量化，檢驗人員可參考不確定度計算結果，提高對結果影響較大的步驟的關注度，從而提高結果的準確性。引入不確定度的測量后，檢測結果可用“測定值+擴展不確定度(U)”表示，從單一值變為測定值可能出現的范圍，該值若在限度值以內，則可判定為合格；若該值在該限度值以外，可判定為不合格；若該值橫跨在限度值兩側，則應重點關注，可通過增加檢測次數或選擇經驗豐富的檢驗員進行復檢以提高結果的準確性。

本文對氣相色譜法測量多西環素中乙醇的含量進行了不確定度評定，對各個影響不確定度的分項如稱量、溶液配制和儀器測量等因素分別進行評定，發現對測量結果影響最大的分量為供試品溶液的配制過程，其余的環節對檢驗結果的影響程度從大到小依次為儀器測量、對照品配制、對照品稱量、供試品稱量。因此在固體制劑的檢驗過程中，檢驗人員要重點關注天平的稱量、容量瓶的使用和氣相色譜儀的使用和維護。在天平的使用過程中，檢驗人員要做到根據樣品性質、天平精度和量程范圍選擇合適的稱樣量，儀器管理人員要定期將玻璃量器送至計量機構進行檢測和校準，對于天平和氣相色譜儀，除定期進行檢定外，還要做到根據維護規程定期維護以保證天平稱重的準確性和色譜峰分離的穩定性，以減小不確定度分量對測定結果不確定度的影響，從而減小測定結果的不確定度。

測量不確定度的評定能夠把握測定過程中影響結果準確性的主要因素，有利于確保相同實驗條件下各個環節的重現性及實驗結果的真實性，為保證檢測方法的可靠性和測量結果的可信度提供了重要的參考依據[11]。