戴 青，陸連壽，趙富華，張秀英

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

乙酰氨基阿維菌素是乙酰氨基阿維菌素B1a和B1b兩個組分的混合物，主要組分為乙酰氨基阿維菌素B1a，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用驅(qū)蟲藥物，是美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟批準(zhǔn)的唯一應(yīng)用于泌乳奶牛無需棄奶的廣譜驅(qū)蟲藥[1-2]，臨床上主要用于防治畜類的虱、螨、蠅等各種內(nèi)外寄生蟲，目前制劑為乙酰氨基阿維菌素注射液和乙酰氨基阿維菌素澆潑劑。經(jīng)國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫查詢，目前我國在有效期內(nèi)的乙酰氨基阿維菌素原料及制劑的獸藥批準(zhǔn)文號有100多個。《中國獸藥典》一部收載了乙酰氨基阿維菌素與乙酰氨基阿維菌素注射液[3]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均需用到乙酰氨基阿維菌素對照品來測定乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)的含量。美國藥典委員會可供應(yīng)乙酰氨基阿維菌素USP對照品，但國外對照品價格昂貴，購買周期長，給國內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)和檢測機構(gòu)的質(zhì)量控制帶來不便。因此，擬研制乙酰氨基阿維菌素對照品，用于乙酰氨基阿維菌素及其制劑的鑒別與含量測定，對于獸藥生產(chǎn)企業(yè)乙酰氨基阿維菌素及制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

本次研制分別采用質(zhì)量平衡法與高效液相色譜外標(biāo)法兩種方法對乙酰氨基阿維菌素原料的含量進行定值研究。其中質(zhì)量平衡法以色譜純度、水分、殘留溶劑、熾灼殘渣等關(guān)鍵指標(biāo)進行定值，高效液相色譜外標(biāo)法以USP對照品作為溯源對照品進行定值，以確保含量賦值的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津2010A高效液相色譜儀；Waters Synapt HDMS質(zhì)譜儀；Agilent 7890A氣相色譜儀；Mettler Toledo XS205電子分析天平(精度0.01 mg)； Metrohm 701 KF Titrino卡氏水分測定儀；CWF 11/5高溫爐。

1.2 試藥 乙酰氨基阿維菌素原料由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；乙酰氨基阿維菌素USP對照品批號1237752，含量95.1%(其中乙酰氨基阿維菌素B1a含量90.09%，B1b含量5.01%)；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶解度 分別考察乙酰氨基阿維菌素原料在甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮、水中的溶解度，測定結(jié)果(表1)與獸藥典中對乙酰氨基阿維菌素溶解度的規(guī)定一致。

表1 乙酰氨基阿維菌素原料的溶解度

2.2 引濕性 根據(jù)獸藥引濕性試驗指導(dǎo)原則，將原料在恒溫恒濕條件下(溫度25 ℃，相對濕度80%)放置24 h后計算增重百分率，判定樣品引濕性。結(jié)果測得樣品的增重百分率為8.7%，表明原料有引濕性。為進一步判定試驗條件下暴露時間對水分的影響，將原料在常規(guī)試驗條件下(溫度25 ℃，相對濕度40%)于天平室內(nèi)敞口放置10、20、30、40、50、60 min，分別計算增重百分率，結(jié)果見表2，10分鐘內(nèi)樣品增重百分率小于0.5%，隨著放置時間延長，逐漸吸濕增重，表明稱量時應(yīng)控制好稱量環(huán)境的濕度，快速稱樣。

表2 乙酰氨基阿維菌素原料增重百分率

2.3 高效液相色譜法結(jié)構(gòu)確證 采用2.6項下的高效液相色譜方法，分別取供試品溶液與對照品溶液進樣，采集液相色譜圖，考察供試品溶液主峰與對照品溶液主峰保留時間是否一致。結(jié)果見圖1～圖2，在乙酰氨基阿維菌素含量測定項下的色譜圖中，乙酰氨基阿維菌素原料主峰與對照品溶液主峰的保留時間一致。

圖1 乙酰氨基阿維菌素USP對照品液相色譜圖

圖2 乙酰氨基阿維菌素原料液相色譜圖

2.4 高分辨質(zhì)譜法結(jié)構(gòu)確證

2.4.1 質(zhì)譜條件 模式：ESI正離子模式；毛細管電壓：2kv；錐孔電壓：10v；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：500L/h。

2.4.2 供試品溶液的制備 取乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，再用20%甲醇溶液稀釋制成每1 mL中含1 μg的溶液，進樣測定分子量。

2.4.3 測定結(jié)果 在該質(zhì)譜條件下，乙酰氨基阿維菌素理論分子量為936.5086，供試品的測定分子量為936.5085(圖3)。供試品的測定分子量與理論值一致。

圖3 乙酰氨基阿維菌素原料質(zhì)譜圖

2.5 質(zhì)量平衡法定值

2.5.1 色譜純度

2.5.1.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.1%高氯酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，45%A，55%B；15～25 min，5%A，95%B；25～30 min，45%A，55%B；30～35 min，45%A，55%B)；流速：1.5 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.5.1.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.1.3 測定結(jié)果 采用峰面積歸一化法分別計算乙酰氨基阿維菌素B1a和B1b的色譜純度，結(jié)果B1a純度為96.60%，B1b純度為2.40%，二者之和為乙酰氨基阿維菌素純度99.00%。

2.5.2 殘留溶劑 據(jù)查閱乙酰氨基阿維菌素原料企業(yè)的生產(chǎn)工藝可知，原料合成過程中所使用的有機溶劑為乙醇、甲醇和丙酮，因此采用頂空氣相色譜法測定這三種有機溶劑的含量。

2.5.2.1 氣相色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5色譜柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液)；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持10 min，再以每分鐘10 ℃的速率升溫至180 ℃，保持1 min；進樣口溫度：200 ℃；氫火焰離子化檢測器溫度：250 ℃；頂空瓶平衡溫度：80 ℃；平衡時間：30 min。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料0.5 g，置20 mL頂空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺5 mL，搖勻，即得。

2.5.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取甲醇、乙醇和丙酮各適量，分別用二甲基甲酰胺稀釋制成48 μg/mL的乙醇對照品溶液、8 μg/mL的甲醇對照品溶液和12 μg/mL的丙酮對照品溶液。

2.5.2.4 測定結(jié)果 取對照品溶液和供試品溶液分別頂空進樣測定，結(jié)果供試品中甲醇和丙酮的含量均低于檢測限，因此忽略不計。按外標(biāo)法計算供試品中乙醇的含量，結(jié)果為0.05%。

2.5.3 水分 照《中國獸藥典》一部附錄0832測定水分，結(jié)果為1.15%。

2.5.4 熾灼殘渣 照《中國獸藥典》一部附錄0841測定殘渣量，結(jié)果為0.02%。

2.5.5 質(zhì)量平衡法計算結(jié)果 質(zhì)量平衡法計算公式為含量=色譜純度×(1-水分-殘留溶劑-熾灼殘渣)×100%，按照這公式分別計算乙酰氨基阿維菌素B1a與B1b的含量，結(jié)果為B1a：96.60%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=95.42%；B1b：2.40%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=2.37%。乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)含量為97.79%。

2.6 高效液相色譜外標(biāo)法定值

2.6.1 液相色譜條件 同2.5.1.1項下色譜條件。

2.6.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.3 對照品溶液的制備 取乙酰氨基阿維菌素USP對照品25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取對照品溶液1.5 mL，置液相進樣瓶中，加1滴1 mol/L氫氧化鈉溶液，放置20 min后進樣。系統(tǒng)適用性溶液色譜圖見圖4，乙酰氨基阿維菌素B1b峰、B1a峰、雜質(zhì)C+D峰和雜質(zhì)E峰的相對保留時間分別為0.77、1.00、1.05和1.29，各峰間分離度均符合要求。

圖4 系統(tǒng)適用性溶液液相色譜圖

2.6.5 方法專屬性研究 為進一步確定雜質(zhì)的分離情況，應(yīng)在測定前進行專屬性試驗考察。在10 mL供試品溶液中分別加入3滴鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉溶液和30%過氧化氫溶液，放置30 min后進樣，另取10 mL供試品溶液水浴加熱5分鐘，放冷后進樣測定，結(jié)果乙酰氨基阿維菌素均產(chǎn)生了雜質(zhì)峰，但主峰與雜質(zhì)均能較好地分離，表明該方法具有較好的專屬性，見圖5～圖8。

圖5 酸破壞試驗液相色譜圖

圖6 堿破壞試驗液相色譜圖

圖7 氧化破壞試驗液相色譜圖

圖8 加熱破壞試驗液相色譜圖

2.6.6 測定結(jié)果 由三個不同實驗室按照該方法進行協(xié)作標(biāo)定，平均結(jié)果為乙酰氨基阿維菌素B1a含量95.79%，B1b含量2.39%。乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)含量為98.18%。

2.7 穩(wěn)定性影響因素試驗 按《中國獸藥典》一部附錄穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則要求，進行高溫(60 ℃)、高濕(相對濕度90%)和光照(4500lx)試驗的穩(wěn)定性影響因素試驗，分裝后的樣品在放置5 d和10 d后，按2.5.1項下方法考察乙酰氨基阿維菌素的純度變化。純度結(jié)果見表3，高濕條件下樣品幾乎無變化，高溫對樣品略有影響，10 d后純度下降0.28%，光照對樣品影響較大，10 d后純度下降2.10%。

表3 穩(wěn)定性影響因素試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 對照品含量賦值 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[4]中列出5種定值方式，單一實驗室通常采用兩種或更多不同原理的獨立參考方法定值。本研究采用質(zhì)量平衡法與高效液相色譜外標(biāo)法兩種不同原理的定值方法測定乙酰氨基阿維菌素含量，測定結(jié)果基本一致，相互佐證，可以保證定值的準(zhǔn)確性。質(zhì)量平衡法通常被認為是一種具有較高準(zhǔn)確度的方法，其能夠直接溯源到國際單位制中的質(zhì)量單位，結(jié)果穩(wěn)定性好，測量結(jié)果比其他方法更準(zhǔn)確，世界衛(wèi)生組織及歐洲藥典推薦質(zhì)量平衡法為藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法[5-6]。雖然本研究兩種方法測定結(jié)果基本一致，但考慮到外標(biāo)法溯源各人間偏差較大，因此本研究最終采用質(zhì)量平衡法的定值結(jié)果對含量進行賦值。

3.2 對照品的穩(wěn)定性 對照品具有較好的穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一個重要前提，使用中需要特別注意穩(wěn)定性問題。本試驗通過對該對照品進行高溫、高濕和光照穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明該對照品對熱和光照均比較敏感，因此應(yīng)避光低溫保存。同時為了保證對照品在保存條件下的含量值的準(zhǔn)確性，根據(jù)獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范[7]要求，我們還應(yīng)對制備的對照品進行穩(wěn)定性監(jiān)測，即在規(guī)定的貯存條件下，定期地進行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的穩(wěn)定性評估。分析該對照品的特性，由于該對照品采用安瓿分裝，水分、殘留溶劑和殘渣都基本不會發(fā)生變化，因此最能反映該對照品的變化的特性值為純度，因此確定第一次監(jiān)測時間為一年后，以后每年定期測定一次。對該對照品的純度進行考察，由1人進行測定，每次測定平行樣不少于5份，測定的結(jié)果與原純度結(jié)果相對偏差不得大于0.3%。