雞源肺炎克雷伯菌的分離鑒定和耐藥性分析

王雅麗，張寶鎖，張 雯，崔生玲，卿素珠，楊 奇*，張為民*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100，2.寧夏回族自治區獸藥飼料監察所，寧夏銀川 7500011，3.寧夏順寶現代農業股份有限公司，寧夏吳忠 751600)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一種常見的革蘭氏陰性條件致病桿菌，為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)成員，多存在于動物黏膜表面或自然環境(如水、土壤等)中[1]，能夠引起動物肺炎、腸炎、腦膜炎和敗血癥等嚴重疾病，也是一種重要的人獸共患病原菌。肺炎克雷伯菌具有多種質粒和可移動遺傳元件，基于此特點該菌可以攜帶多種抗性基因或從環境中獲得并積累抗性基因，或將耐藥基因傳遞給敏感菌株，從而可能導致多重耐藥或者超級耐藥細菌的出現[2-3]。肺炎克雷伯菌是引起醫院臨床感染的主要細菌之一[4]，2020年中國細菌耐藥監測報告顯示，肺炎克雷伯菌分離率在醫源革蘭氏陰性菌位居第二位，僅次于大腸埃希菌，且耐藥率也呈現明顯上升趨勢[5]。

近年來，由于肺炎克雷伯菌對蛋雞的危害增大和耐藥性嚴重，常引起禽類肺炎、眼炎、肝膿腫、腸炎、敗血癥和生殖系統疾病等。基于此，本試驗從蛋雞糞便中分離鑒定肺炎克雷伯菌，并對分離菌株的耐藥表型、耐藥基因和毒力基因進行檢測，以了解肺炎克雷伯菌的耐藥現狀和毒力基因流行情況，為動物臨床用藥提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 選擇寧夏回族自治區某規模化蛋雞場為采樣點，在雞舍內隨即選取臨床健康雛雞(n=36)和產蛋雞(n=24)，用無菌棉簽蘸取其排泄的新鮮糞便(扒開糞便表皮，蘸取內部糞便)，置于無菌采樣袋，共60份。

1.1.2 標準菌株 大腸埃希菌(ATCC25922)和肺炎克雷伯菌(ATCC13883)由寧夏回族自治區獸藥飼料監察所提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂(MIAC)購自青島海博生物技術有限公司；VITEK 2革蘭氏陰性細菌鑒定卡購自生物梅里埃有限公司；革蘭氏陰性細菌藥敏板(動物源)購自上海星佰生物技術公司；全自動微生物鑒定儀(VITEK2)購自梅里埃診斷產品有限公司；PCR儀購自德國耶拿分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養 將糞便稀釋于蛋白胨緩沖液中增菌培養30 min，濾液添加至麥康凱肉湯孵育18～24 h。將菌液劃線接種于MIAC培養基，37 ℃培養18～24 h。挑取培養基上單個、圓形、呈粉紅色至紫紅色且帶沉淀環的菌落，再次劃線接種使其純化，直至平板上菌落形態一致且符合肺炎克雷伯菌菌落特征。每次傳代培養均設置肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC13883為陽性對照，未接種培養基為陰性對照，并同條件培養。

1.2.2 PCR鑒定 采用煮沸法提取待測菌株模板DNA。參考文獻[6]合成肺炎克雷伯菌的特異性基因溶血酵素khe基因，上游引物5′-TGATTGCATTCGCCACTGG-3′，下游引物5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′，目的基因片段大小為428 bp。PCR擴增體系(20 μL)：2×DreamTaq Green Mix 8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL和ddH2O 8 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物用1.25%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.3 VITEK2 Compact全自動微生物系統鑒定 用無菌棉拭子挑取適量形態相似的菌落混懸于0.45%的無菌生理鹽水中，使其終濃度為0.5～0.63麥氏濁度。將菌液管和革蘭氏陰性鑒定卡放入卡架中，裝入梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統中自動鑒定。

1.2.4 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化委員會CLSI相關標準進行操作和結果判定。采用革蘭氏陰性細菌藥敏板對分離株進行14種常用抗菌藥物的敏感性檢測，包括氨芐西林(AMP)、奧格門丁(A/C)、慶大霉素(GEM)、大觀霉素(SPT)、四環素(TET)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異噁唑(SF)、復方新諾明(甲氧卞定/磺胺甲惡唑，SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)和黏菌素(CL)。大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株。

1.2.5 耐藥基因和毒力基因檢測 依據參考文獻[7-16]設計耐藥基因和毒力基因引物，由西安擎科新業生物技術有限公司合成。具體引物信息見表1和表2，包括β-內酰胺類耐藥基因blaNDM、blaKPC、blaCTX和blaTEM，氨基糖苷類aac(6')-Ib-cr、aadA1和rmtB、四環素類tetA和tetB，喹諾酮類qnrA、oqxA、oqxB、qnrB和gyrA以及粘菌素類mcr-1，共15種耐藥基因。毒力基因包括莢膜多糖基因rmpA，脂多糖合成相關基因wabG和uge，鐵捕獲能力kfuBC和Aerobactin以及鐵載體entB和icuA。除退火溫度外，反應體系與反應程序同1.2.2。

表1 肺炎克雷伯菌耐藥基因序列

表2 肺炎克雷伯菌毒力基因引物序列

2 結 果

2.1 肺炎克雷伯菌株的菌落特征 肺炎克雷伯菌在MIAC培養基上形成邊緣光滑濕潤、中間凸起的紫紅色菌落，菌落周圍有沉淀環(圖1)。

圖1 肺炎克雷伯菌在MIAC培養基上的菌落形態

2.2 分離株PCR鑒定 肺炎克雷伯菌特異性基因khe的擴增產物大小為428 bp。以標準菌株ATCC13883為陽性對照，對分離株進行基因擴增、核酸凝膠電泳鑒定，60份樣本中有48株菌株出現預期目的條帶，與標準菌株結果一致(圖2)。

圖2 部分菌株khe基因擴增電泳鑒定結果

2.3 生化儀鑒定 VITEK2 Compact鑒定是在細菌生化反應的基礎上，比對分析待檢細菌的生化反應譜與對數期菌株的生物學特征來鑒定菌種。結果顯示，48株PCR陽性的分離株均為肺炎克雷伯菌，可信度均在90.00%以上，分離率為80.00%(48/60)，其中雛雞糞便中肺炎克雷伯菌的分離率(36/36)高于產蛋雞(12/24)。

2.4 藥敏檢測結果

2.4.1 分離菌株對14種抗菌藥物敏感性檢測結果 藥敏檢測結果顯示：質控菌株藥敏結果在規定范圍內，分離菌株對氨芐西林、大觀霉素、四環素、氟苯尼考、磺胺異噁唑和復方新諾明的耐藥率分別為100.00%、79.17%、81.25%、50.00%、72.91%和72.91%，呈現出高度抗藥性。對奧格門丁、慶大霉素、頭孢類和喹諾酮類藥物耐藥程度較低，耐藥率為14.58%～27.08%，未檢測出對美羅培南和黏菌素耐藥的菌株(表2)。

表3 肺炎克雷伯菌分離株對14種抗菌藥物藥敏檢測結果

2.4.2 雛雞和產蛋雞肺炎克雷伯菌分離株耐藥率統計 對雛雞和產蛋雞糞便分離到的肺炎克雷伯菌的藥敏結果進行分析比較(圖3)。結果顯示各生長階段分離菌株對氨芐西林均耐藥，對美羅培南和黏菌素均敏感，此外雛雞源分離菌株對大觀霉素、四環素、磺胺異噁唑和復方新諾明耐藥率均高于90.00%，且對其他11種抗菌藥的耐藥率均高于產蛋雞。

圖3 不同生長階段肺炎克雷伯菌分離株耐藥率統計

2.4.3 分離菌株多重耐藥分析 對分離株的耐藥譜進行統計分析。結果顯示，12.50%菌株表現雙重耐藥，75.02%分離株表現為多重耐藥(≥3類抗菌藥)，其中5重耐藥的菌株占比最高，為22.92%，最高為8重耐藥，占10.42%(圖4)。

圖4 肺炎克雷伯菌分離株多重耐藥率統計

2.5 耐藥基因和毒力基因檢測 48株肺炎克雷伯菌的耐藥基因和毒力基因檢測結果見表4可知，共檢出6種耐藥基因，分別是blaTEM、aadA1、tetA、qnrB、oqxA和oqxB，以及uge、wabG、kfuBC和entB4種毒力基因，其他耐藥基因和毒力基因未檢出。

表4 肺炎克雷伯菌分離株耐藥基因和毒力基因檢出情況(%)

2.6 耐藥基因與耐藥表型比較分析 對48株肺炎克雷伯菌的耐藥表型和耐藥基因進行比較分析，結果見表5。氨基糖苷類和四環素類耐藥表型陽性率與aadA1和tetA基因的檢出情況基本符合，其耐藥表型高于基因型。在全部耐β-內酰胺類藥物的分離菌株和1株中介程度的菌株中均檢測出了blaTEM基因。喹諾酮類藥物方面，中介菌株qnrB基因陽性率高于耐藥菌株，oqxA和oqxB基因在其耐藥、中介和敏感菌株中均有檢出。

表5 肺炎克雷伯菌耐藥表型與基因型的比對情況

3 討論與結論

近年來，從雛雞、奶牛、貂和犬等多種患病動物均分離出高致病性、多重耐藥肺炎克雷伯菌[17-20]。本研究從60份健康蛋雞的糞便中分離到48株肺炎克雷伯菌，分離率為80.00%。藥敏試驗結果顯示，分離菌株對氨芐西林、大觀霉素、四環素、氟苯尼考、磺胺異噁唑和復方新諾明均表現出高度耐藥性，其中對氨芐西林屬于固有耐藥[21]，對奧格門丁、慶大霉素、頭孢類和喹諾酮類藥物耐藥程度較低，而對黏菌素和美羅培南敏感。多重耐藥情況較為嚴重，75.02%的分離菌株表現出多重耐藥性，其中以5重(22.92%)和7重耐藥菌(18.75%)為主，最高表現為8重耐藥菌(10.42%)。有研究表明，河南省雞源肺炎克雷伯菌(來自雞場環境、病死雞和市售雞肉)對環丙沙星(71.70%)和四環素(66.04%)表現出高度耐藥，49.06%的分離菌株表現為多重耐藥[19]，低于本研究分離菌株的耐藥水平；河北省乳房炎奶牛源分離到的肺炎克雷伯菌對慶大霉素和頭孢喹肟表現中度耐藥，耐藥率為48.90%和55.60%，高于本試驗結果[18]，可見不同地區畜禽肺炎克雷伯菌耐藥性有差異，可能是臨床常用藥物存在差異導致。

本研究中雛雞源分離菌株對大觀霉素、四環素、磺胺異噁唑和復方新諾明耐藥率均高于90%，且對除氨芐西林、美羅培南和黏菌素外的11種抗菌藥物耐藥率均高于產蛋雞。需要注意的是，1株雛雞源肺炎克雷伯菌對12種抗菌藥物表現出耐藥性，以及2株產蛋雞源肺炎克雷伯菌表現出多重耐藥性。對該蛋雞養殖場抗菌藥使用記錄調查發現，采集樣本的雞舍并未存在不規范或大量使用抗菌藥情況，且雞入舍以來僅使用過頭孢類藥物，因此可能是養殖場內部環境消毒不徹底，存在細菌耐藥性的積累或蛋雛雞親代種群垂直傳播而導致的高度耐藥性。

肺炎克雷伯菌具有多種質粒和可移動的遺傳元件，是耐藥基因的主要傳播載體[3]。從48株肺炎克雷伯菌分離菌株中檢出6種耐藥基因，其中oqxA和oqxB檢出率最高，幾乎在所有分離菌中檢出，與陳強[22]研究一致。研究顯示，oqxA和oqxB參與編碼肺炎克雷伯菌外排泵，除介導喹諾酮類耐藥外，還能夠降低菌株對替加環素和呋喃妥因的敏感性[23]。blaTEM基因的陽性率與β-內酰胺類耐藥表型相符率較高，而aadA1、tetA和qnrB在耐氨基糖苷類、四環素類和喹諾酮類的菌株檢出率較低，存在其他耐藥基因未檢出的可能性。

本研究對分離的雞源肺炎克雷伯菌莢膜、脂多糖和鐵源攝取系統共7種毒力基因進行了檢測，其中entB、wabG、uge檢出率較高，kfuBC檢出率較低，而rmpA、Aerobactin和icuA基因未檢出。腸桿菌素生物合成鐵載體(entB)是一種由菌體細胞分泌的、能夠高度親和Fe3+的特異性鐵螯合劑，以幫助細菌攝取鐵源，在菌株毒力中起關鍵作用[24]，wabG基因能夠調控肺炎克雷伯菌脂多糖的合成，以及莢膜形成，幫助菌株躲避細胞的吞噬作用，并增強菌株的粘附能力[8,25]。uge基因參與肺炎克雷伯菌核心脂多糖的生物合成，人為構建的uge基因突變體能夠顯著降低菌株的毒力和感染宿主的能力[26]。據報道，貢嘎等[27]從患呼吸道疾病的牦牛中分離到的8株肺炎克雷伯菌均攜帶mrkD、fimH和wabG；張傳美等[20]從患肺炎的水貂中分離的10株肺炎克雷伯菌，均攜帶uge、ureA、wabG和iucB基因，與本試驗中uge和wabG毒力基因檢出率相似。

研究結果表明，雞場肺炎克雷伯菌分離率較高，且分離菌株對常見抗菌藥物耐藥程度較為嚴重，可為該地區耐藥性監測和疾病防控提供參考依據。