參苓白術散與腎氣丸干預脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠的代謝組學研究

王婧婧 古詩琴蔡瑩 孫相如 楊艷紅 胡方林

（湖南中醫藥大學， 湖南 長沙410208）

潰瘍性結腸炎是一種主要累及直腸、結腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，屬于炎癥性腸病范疇，臨床主要表現為腹瀉、腹痛、黏液膿血便及里急后重等［1］。中醫基于“病證結合”與“辨證論治”的診療體系及治療方式，在促進潰瘍愈合、減輕患者癥狀、增強體質等方面取得了顯著的療效。

潰瘍性結腸炎可歸屬于中醫學中“休息痢”“大瘕瀉”“大腸脹”等范疇，邪客于大腸，與氣血搏結，血絡損傷，肉腐成膿，如遷延不愈，進展至疾病后期，多會出現脾腎陽虛的表現［2］。明代醫家薛己首創朝夕互補法治療虛損病，朝用補中益氣湯，夕用腎氣丸治療脾腎虧損證［3］。脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎久泄傷陰，陰損及陽，臨床朝用參苓白術散培補脾土，健脾止瀉，滋其化源；夕用腎氣丸溫補腎陽，補火生土，脾腎并重治療脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎療效顯著［4］，但其作用機制尚不明確。

代謝組學因其具有高通量、高靈敏度、高精確性的優勢，能定性或定量動態檢測機體小分子代謝產物的變化，具有整體性和動態性［5?6］。因此，本研究采用基于LC?QTOF?MS 的代謝組學方法，對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織代謝物進行分析鑒定，篩選差異代謝物，從內源性代謝角度探討參苓白術散與腎氣丸“朝夕互補”干預脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠32只，體質量（200±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2019?0009。大鼠分籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～65%。本研究方案經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（編號LL2020090901）。

1.2 藥物 參苓白術散（人參15 g、白術15 g、白茯苓15 g、炒甘草10 g、薏苡仁9 g、蓮子肉9 g、縮砂仁6 g、白扁豆12 g、炒桔梗6 g、山藥15 g、大棗3 枚）、腎氣丸（干地黃24 g、山藥12 g、山茱萸12 g、澤瀉9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、炮附子3 g、桂枝3 g），藥材飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房，經湖南中醫藥大學胡方林教授鑒定為正品。按原方比例稱取藥材［7］，常規煎法煎煮2次，第1 次加8 倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，取煎液，第2 次加5 倍量水，煎煮30 min，取煎液，2 次煎液混合后濃縮，參苓白術散湯劑和腎氣丸湯劑分別濃縮至生藥量1 g／mL。大黃中藥材煎煮方法同前，濃縮至生藥量1.35 g／mL，4 ℃冰箱保存備用［8］。美沙拉嗪腸溶片研磨成粉劑備用。

1.3 試劑 三硝基苯磺酸（TNBS，批號SLCG2384），購自美國Sigma 公司；氫化可的松注射液（批號2008201），購自國藥集團容生制藥有限公司；便隱血（OB）試劑（批號B200901），購自珠海貝索生物技術有限公司；美沙拉嗪腸溶片（批號20200604），購自黑龍江天宏藥業股份有限公司。乙腈、甲酸均為色譜純，購自德國默克公司。

1.4 儀器 液相色譜?四級桿／飛行時間質譜聯用儀（型號Triple TOFTM5600，美國AB SCIEX 公司）；脫水機、包埋機（型號JJ?12J、JB?P5，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（型號RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；正置光學顯微鏡、成像系統（型號Nikon Eclipse E100、Nikon DS?U3，日本尼康公司）。

2 方法

2.1 造模 脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立采用病證結合法，參考文獻［8］ 報道，第一階段復制“脾虛”模型，正常組大鼠灌胃給予蒸餾水，每只2 mL，模型組大鼠上午灌胃給予大黃水煎液，每只2 mL，連續14 d；第二階段復制“脾腎陽虛”模型，第15 天在模型組大鼠左右肢臀部交替處肌肉注射氫化可的松25 mg／kg，連續10 d，第25 天禁食不禁水，第26 天用100 mg／kg TNBS 加50%乙醇0.25 mL 混合試劑灌腸，正常組用等體積蒸餾水灌腸，進而建立脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型。

2.2 模型評判標準 造模后第3天，從正常組和模型組分別隨機選取2 只大鼠處死，鏡下觀察結腸組織結構、炎癥及潰瘍損傷等情況。參照《中醫虛證辨證參考標準》的“證候診斷”標準［9］進行評價，①大便溏泄，甚則脫肛；②消瘦，食欲下降，體質量減輕；③畏寒，弓背，蜷縮聚堆；④神態萎靡，毛色枯槁無光澤；⑤易疲勞乏力，嗜臥，第①～③項為脾腎陽虛證主癥，第④⑤項為脾腎陽虛證兼癥。具備2 項主癥及2 項兼癥即可認為脾腎陽虛證模型復制成功。在宏觀體征表現的基礎上，結合鏡下結腸黏膜病理變化判斷模型制備成功與否。

2.3 分組與給藥 脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎成模大鼠按隨機數字表法分為模型組、朝夕互補方組、美沙拉嗪組，每組7 只。從造模后第7 天開始給藥，藥物劑量按成人臨床等效劑量換算為大鼠給藥劑量［10］，朝夕互補方組上午灌胃給予5.04 g／kg 參苓白術散湯劑，下午灌胃給予3.645 g／kg腎氣丸湯劑；美沙拉嗪組灌胃給予0.18 g／kg 美沙拉嗪混懸液；正常組和模型組灌胃給予1 mL／kg 0.9%生理鹽水，每天上午9 時～10 時灌胃，下午5 時～6 時灌胃，連續21 d。

2.4 大鼠一般情況觀察 觀察大鼠的精神狀態、毛發色澤、飲食量、大便性狀、死亡等情況。

2.5 大鼠疾病活動指數（DAI）評分 從給藥第1 天起，每3 d 記錄大鼠體質量變化、糞便性狀和隱血，采用匹拉米洞半定量檢測法檢測大鼠糞便隱血。參考Hamamoto［11］標準進行DAI 評分，見表1，評估造模后潰瘍性結腸炎的活動程度。DAI 評分＝（體質量下降計分＋大便性狀計分＋大便隱血情況計分）／3。

表1 DAI 評分標準

2.6 結腸組織病理形態評價 取出固定于4%多聚甲醛溶液中的病變結腸組織，石蠟包埋后制作病理切片，再進行HE 染色。鏡下觀察結腸組織結構、炎癥及潰瘍損傷等情況。參照Morris［12］標準評分，見表2，求和并取平均值。

表2 病理組織學評分標準

2.7 結腸組織代謝組學檢測

2.7.1 色譜條件 Waters Acquity HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～13 min，1%B；13～16.5 min，99%B；16.5～20 min，1%B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

2.7.2 質譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），正負離子模式檢測；正離子噴霧電壓（ISVF）5 500 V，負離子ISVF－4 500 V；霧化氣溫（TEM）550 ℃；霧化氣（GS1）和輔助氣（GS2）均為55 psi；氣簾氣（CUR）35 psi；正離子碰撞能量（CE）10 V，負離子CE－10 V；正離子去簇電壓（DP）80 V，負離子DP－80 V；掃描范圍60～1 000m／z。

2.7.3 數據處理及多元統計分析 使用Proteo Wizard 軟件將質譜原始數據轉成mzXML 格式，使用XCMS 進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等。利用R 語言中的StatTarget 包對信號進行校正，各組積分峰面積值為代謝物的含量，以（）表示。將 數據導入Metabo Analyst4.0（www.metaboanalyst.ca）軟件進行歸一化處理后，應用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS?DA）分別顯示不同組別在計分圖上的分布。PCA 在最大程度提取原始信息的同時對數據進行降維處理，通過主成分來描述機體代謝的情況；PLS?DA 則可使組間差異最大化。為了尋找潛在的生物標志物，通過組與組之間兩兩對比，從正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS?DA）負荷圖中篩選VIP ＞1.5（VIP 表示投影中可變重要性）的離子，并對這些離子進行t檢驗、變異倍數分析FC（fold change analysis）的單變量統計檢驗。P＜0.05 并且FC＞1.5（或＜0.67）的離子最終被認為是潛在的內源性差異代謝物。利用鑒定出的差異代謝物KEGG ID 進行代謝通路分析。

2.8 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，單變量的計量資料樣本均數間比較，若符合正態分布，用單因素方差分析，多重比較用LSD 分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 朝夕互補方對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠一般情況的影響 與正常組大鼠比較，模型組大鼠出現蜷臥少動，行動遲緩，喜扎堆，弓背，腹脹，毛發亂無光澤，耳及四肢爪甲色淡白，舌質紫暗，尿液清，大便稀溏色黑，肛周污染，生物學表征符合脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎的臨床證候特點；美沙拉嗪組大鼠大便由稀溏轉為松散，顏色由黑轉為黃褐色，腹脹減輕，毛發逐漸光澤，行動稍遲緩，喜扎推，無弓背，耳及四肢爪甲色淡紅；朝夕互補方組大鼠大便形狀逐步恢復正常，由稀溏轉為松散至顆粒狀，顏色由黑轉為黃褐色，尿液色淡黃，無腹脹，毛發逐漸光澤，行動逐步靈活，耳及四肢爪甲色逐漸紅潤。

3.2 朝夕互補方對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠DAI 評分的影響 模型組大鼠DAI 評分隨時間延長呈上升趨勢，且高于正常組；從治療第3 天開始，美沙拉嗪組和朝夕互補方組大鼠DAI 評分呈下降趨勢，朝夕互補方組大鼠DAI 評分趨于正常組，且優于美沙拉嗪組，見圖1。

圖1 各組大鼠DAI 評分（n＝7）

3.3 朝夕互補方對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病理變化的影響 正常組大鼠結腸組織表面光滑良好，黏膜各層結構完整，無炎性細胞浸潤，黏膜無充血水腫及潰瘍形成；模型組大鼠結腸黏膜充血水腫、潰瘍形成，黏膜組織可見大量炎性細胞（如中性粒細胞）浸潤，病理評分高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸黏膜結構有不同程度的改善，炎性細胞浸潤減少，組織病理評分均低于模型組（P＜0.01），其中朝夕互補方作用優于美沙拉嗪，見圖2、表3。

表3 各組大鼠結腸組織病理評分比較（，n＝7）

表3 各組大鼠結腸組織病理評分比較（，n＝7）

注：與正常組比較，??P＜0.01 ；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖2 各組大鼠結腸組織病理圖（HE，×200）

3.4 朝夕互補方對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織代謝組學的影響

3.4.1 結腸組織PCA、PLS?DA 分析 點代表樣本，所有樣本點均分布在95% 置信區間。圖3A 為PCA 分析結果，正常組與模型組完全分離，其代謝輪廓相異；朝夕互補方組、美沙拉嗪組在正常組與模型組之間。圖3B 為PLS?DA分析結果，正常組、模型組、朝夕互補方組、美沙拉嗪組樣本分離，說明其代謝輪廓相異。提示，朝夕互補方干預后，脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織代謝輪廓向正常組靠近，表明內源性代謝紊亂有所改善。

圖3 各組大鼠結腸組織PCA（A）、PLS?DA（B）得分圖

3.4.2 PLS?DA 交叉驗證 交叉驗證用于評價模型的質量，R2為模型建立的準確率，R2越高，表示模型的質量高。Q2為模型的預測準確率，Q2越高，表示模型的預測能力越高。由圖4 可得，大鼠結腸組織樣本R2＝0.996，Q2＝0.749，說明模型的質量與預測準確率均較好，不存在“過擬合”現象。

圖4 大鼠結腸組織PLS?DA 交叉驗證圖

3.4.3 差異代謝物的篩選 以VIP＞1.5、P＜0.05、FC＞1.5（或＜0.67）為篩選條件，最終得到26 個模型組與正常組間差異代謝物，對這些差異代物的定量信息進行熱圖分析，見圖5。顏色深淺表示不同的強度，從紅色到藍色，表示強度從高到低。結果顯示，不同組別的個體均能很好地聚集在各自的組別中，說明這26 個差異代謝物能夠將4 組完全區分。

圖5 各組大鼠結腸組織差異代謝物熱圖

3.4.4 最終差異代謝物篩選及代謝通路分析 首先篩選出正常組與模型組之間的差異代謝物，在此基礎上觀察美沙拉嗪和朝夕互補方對這些代謝物的影響。朝夕互補方對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎相關的17 個代謝物有改善作用（P＜0.05，P＜0.01），代謝物信息詳見表4。將17 個差異代謝標志物進行MetPA 分析，得到14 條代謝通路（P＜0.05），其中嘌呤代謝（0.200）、氨基糖和核苷酸糖代謝（0.121）2 條代謝通路的影響值大于0.1，可作為主要代謝通路，見圖6。

圖6 差異代謝物MetPA 通路分析

表4 各組大鼠結腸組織差異代謝物比較（，n＝7）

表4 各組大鼠結腸組織差異代謝物比較（，n＝7）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4 討論

本實驗采用基于LC?QTOF?MS 的代謝組學方法探討參苓白術散與腎氣丸“朝夕互補”對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠的作用機制。朝夕互補方可使紊亂的代謝譜向正常的趨勢回歸，篩選出17 個與脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎相關的差異代謝物，涉及14 條代謝通路，可部分揭示朝夕互補方的作用機制。

4.1 氨基酸代謝 色氨酸是一種在免疫調節過程中起關鍵作用的氨基酸，在巨噬細胞內通過犬尿氨酸途徑生成3?羥基鄰氨基苯甲酸［13］。模型組大鼠3?羥基鄰氨基苯甲酸含量升高，顯示機體色氨酸代謝紊亂；經朝夕互補方干預后下調，提示其可能通過糾正色氨酸代謝紊亂以減輕潰瘍性結腸炎大鼠炎癥反應。N6?乙酰?L?賴氨酸是賴氨酸降解的中間產物，N?α?乙酰賴氨酸是賴氨酸與乙酰輔酶A 進行乙酰化的中間代謝物［14］。賴氨酸作為一種

必須氨基酸，具有促進機體發育，提高免疫功能的作用。賴氨酸乙酰化調節巨噬細胞中代謝酶的活性、穩定性以及控制炎癥因子的產生從而調節炎癥反應［15］。模型組N6?乙酰?L?賴氨酸、N?α?乙酰賴氨酸含量升高；經朝夕互補方干預后下調，提示其可能通過調節賴氨酸代謝發揮抗炎作用。

4.2 嘌呤代謝 鳥苷是一種以鳥嘌呤為基礎的細胞外信號分子，可提高髓過氧化物酶活性以發揮抗炎和抗氧化作用［16］。肌苷酸是磷酸鳥苷的胞內前體，通過代謝肌苷發揮作用［17］。研究表明，肌苷對TNBS 誘導的大鼠結腸炎可通過促進尿酸生成發揮抗炎作用［18］。模型組鳥苷、肌苷酸和磷酸鳥苷含量升高；經朝夕互補方干預后下調，提示其可能通過干預嘌呤代謝促進尿酸生成發揮抗炎、抗氧化作用。

4.3 脂類代謝 胞磷膽堿是內源性合成磷脂酰膽堿的中間體，參與細胞膜的形成和修復［19］。3?羥甲基戊二酸是膽固醇代謝的中間產物［20］。膽固醇參與維持細胞膜的通透性和流動性以及跨膜信號通路的調節［21］。模型組胞磷膽堿、3?羥甲基戊二酸含量升高，可能由于潰瘍性結腸炎結腸組織抗氧化能力下降，細胞釋放活性氧與活性氮破壞細胞膜的穩定性［18］；經朝夕互補方干預后下調，提示其可能通過干預膽固醇代謝，修復細胞膜，維持細胞膜的穩定性以改善結腸黏膜損傷。甘油酸是甘油氧化產物，能促進內源性前列腺素的合成，增加黏膜血流量，增強胃腸平滑肌收縮［22］。模型組甘油酸含量降低；經朝夕互補方干預后上調，提示其可能通過促進甘油氧化，增加黏膜血流量以促進潰瘍愈合，增強胃腸平滑肌收縮，促進胃腸蠕動以減輕大鼠腹脹。

4.4 能量代謝 尿苷二磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸半乳糖是基于尿苷二磷酸的2 個己糖變體，可分解代謝ATP 為機體提供能量［23］。十二烷二酸是一種含12 個碳原子的飽和脂肪族二元酸，能為ATP 合成提供中間底物，且能量密度較高，可作為腸外營養的替代燃料底物之一［24?26］。上述代謝物在模型組中含量升高，與潰瘍性結腸炎炎癥部位新陳代謝增加需要消耗大量能量相符；經朝夕互補方干預后恢復至正常水平，提示其可能通過糾正能量代謝紊亂以改善結腸組織炎癥反應。

4.5 維生素代謝及其他 泛酸（維生素B5）具有促進代謝和抗氧化的作用，參與輔酶A 合成，高度依賴輔酶A 的結腸組織在泛酸缺乏時易造成細胞損傷［27］。β?胍基丙酸是肌酸類似物，能夠提高機體內線粒體酶活性，改善線粒體功能，提高抗氧化能力［28］。本研究發現，經朝夕互補方干預后，可上調泛酸和β?胍基丙酸，提示其可能通過干預維生素代謝，促進輔酶A 合成，增強抗氧化能力以減輕炎癥。

綜上所述，參苓白術散與腎氣丸“朝夕互補”可改善脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠的宏觀體征，減輕結腸炎癥，促進潰瘍愈合，聯合結腸組織代謝組學發現其差異代謝物主要參與氨基酸代謝、氧化應激反應及能量代謝等。