龍膽瀉肝丸（片）中當歸摻偽情況研究

余榮蘭 楊建冬 袁秀澤 鄧杰華 黃招光 周云峰?

（1.淳安縣第一人民醫院， 浙江 杭州311700； 2.宜春市食品藥品檢驗所， 江西 宜春336000）

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根［1］，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效［2?4］。當歸屬于食藥同源藥材，需求量大［5］，近年來，隨著野生資源日益枯竭，當歸市場價格水漲船高，出現了各種混淆品和偽品［6?8］，其中在當歸中摻入價格較為低廉的獨活栽培品較為常見。獨活為傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubescensMaxim.F.biserrata Shan et Yuan 的干燥根，具有祛風除濕、通痹止痛的功效，其與當歸同屬傘形科，外觀性狀差異小，但臨床功效有較大區別，不可混用。

龍膽瀉肝丸（片）是由多種藥味組成的復方制劑［9?10］，具有清肝膽、利濕熱的功效，方中含有當歸。鑒于市場上有獨活混淆品出現，其有可能會帶入以當歸為藥味的中藥復方制劑中，有必要開展龍膽瀉肝制劑中獨活篩查的探索性研究。當歸主要含藁本內酯、阿魏酸、洋川芎內酯I等［11］，獨活含有蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、二氫歐山芹醇等成分［12］。蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯是獨活的定量特征成分，基于此，本研究建立可測定蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC?MS／MS），篩查龍膽瀉肝丸（片）中當歸原料是否摻雜獨活，為龍膽瀉肝制劑整體質量的控制提供科學依據。

1 材料

H?class／xevo 超高效液相色譜?三重四極桿質譜儀（美國Waters 公司）；PL?S60 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。蛇床子素（批號110822?201710，含量99.5%）、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品（批號111583?201605，含 量98.6%）。當歸對照藥材（批號120927?201617）、獨活對照藥材（批號120940?201612）均購自中國食品藥品檢定研究院；柴胡（江西臻藥堂藥業股份有限公司，批號200504，產地山西）、龍膽（江西藥都堂中藥飲片有限公司，批號20190301，產地云南）、黃芩（江西康齊樂中藥材有限公司，批號20210401，產地山西）、梔子（江西康齊樂中藥材有限公司，批號20210201，產地江西）、鹽澤瀉（江西寶芝堂中藥飲片有限公司，批號201001，產地四川）、木通（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號201101，產地湖北）、車前子（樟樹市慶仁中藥飲片有限公司，批號201905353，產地江西）、當歸（安徽百歲堂中藥飲片有限公司，批號210501，產地甘肅定西）、地黃（鄭州瑞龍制藥股份有限公司，批號21050405，產地河南）、炙甘草（江西康齊樂中藥材有限公司，批號20201101，產地甘肅），由宜春市食品藥品檢驗所楊建冬主任中藥師鑒定為正品；龍膽瀉肝丸（片）共49批，均來源于零售和連鎖藥店，生產企業涉及26 家。實驗用水為超純水；其他試劑均為質譜級。

2 方法與結果

2.1 質譜和色譜條件 電噴霧離子源；碰撞氣氬氣；脫溶劑氣體流量1 000 L／h；錐孔氣流量50 L／h；ESI 溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；毛細管電壓0.5 V；采用多反應檢測（MRM）模式，正離子掃描，其他質譜參數見表1。Waters ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸?乙腈，梯度洗脫（0～2 min，25% A；2～5 min，25%～75% A；5～8 min，75%A；8～8.5 min，75%～25% A；8.5～11 min，25% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

表1 質譜參數

2.2 溶液制備 蛇床子素對照品溶液：稱取蛇床子素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含蛇床子素164.0 ng 的溶液，精密量取2、5、10、20、25 mL 分別置50 mL 量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液：稱取二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含二氫歐山芹醇當歸酸酯99.59 ng 的溶液，再精密量取2、5、10、20、25 mL 分別置50 mL 量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液：取本品適量，片劑、水丸和濃縮丸研細，大蜜丸加等量硅藻土混勻研細，取2 g，置100 mL 量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。自制樣品溶液：稱處方比例（龍膽120 g、柴胡120 g、黃芩60 g、梔子60 g、澤瀉120 g、木通60 g、車前子60 g、當歸60 g、地黃120 g 和炙甘草60 g）自制原粉混合樣品約2 g，制備樣品溶液。陰性樣品溶液：稱取不含當歸的原粉混合樣品約2 g，制備陰性樣品溶液。當歸對照藥材溶液：稱取當歸對照藥材約2 g，制備當歸對照藥材溶液。獨活對照藥材溶液：稱取獨活對照藥材約2 g，置100 mL 量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理30 min，放冷，精密吸取續濾液0.1 mL 置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察 取蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液分別進樣測定峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，見表2。結果表明，蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯在各自范圍內線性關系良好。以信噪比為3∶1 時的對照品質量濃度作為儀器檢測限。

表2 各成分線性關系

2.4 專屬性試驗 對陰性樣品、對照藥材、自制樣品、供試品、混合對照品溶液依次測定，見圖1。蛇床子素對照品保留時間約為6.85 min，二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品保留時間約為7.05 min，陰性樣品、對照藥材和正常樣品均無色譜峰，說明樣品中各藥味對測定無干擾，專屬性良好。

圖1 各成分色譜圖

2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，蛇床子素峰面積RSD 為2.07%，二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 為1.64%，表明精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批樣品6份，每份約2 g，測定含量。蛇床子素含量RSD 為2.34%，二氫歐山芹醇當歸酸酯含量RSD 為2.75%，重復性結果符合要求。

2.7 穩定性試驗 取供試品溶液，在0、1、2、4、8、16 h測定峰面積。蛇床子素含量RSD 為3.16%，二氫歐山芹醇當歸酸酯含量RSD 為3.74%，表明供試品溶液在16 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取樣品6份，各約1 g，置于100 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液（蛇床子素573.9 ng／mL、二氫歐山芹醇當歸酸酯149.4 ng／mL）5 mL，測定峰面積，計算回收率，見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果

2.9 含量測定 49 批龍膽瀉肝丸（片）有3 批樣品檢出獨活特征性成分，其中片劑2 批、丸劑1批，檢出率約為6%。檢出蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的有3 批樣品，計算含量，結果見表4，每批樣品平行測定2 次。蛇床子素含量范圍為0.005 615～2.601 μg／g，二氫歐山芹醇當歸酸酯含量范圍為0.038 43～0.823 2 μg／g。

表4 含量測定結果（μg／g）

3 討論

通過質譜發現蛇床子素的主要碎片離子為245、189、159、131、103、77；二氫歐山芹醇當歸酸酯的碎片離子為329、311、251、229、187、83，有3 批樣品檢出與各對照品相應的碎片離子。通過離子豐度比可知，樣品與蛇床子素對照品的離子豐度比基本一致，而與二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品的有一定差別，但獨活對照藥材與樣品基本相同，分析原因可能是二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品屬于純度較高的化合物，其他雜質對其無干擾，而樣品中的二氫歐山芹醇當歸酸酯來自獨活，可能存在二氫歐山芹醇當歸酸酯的立體異構體的干擾［13］，因為原化合物與立體異構體的離子豐度比會有差異［14］。蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯屬于香豆素類化合物［15］，在水煎液中的轉移率為2.3%～10.1%和2.3%～12.2%［16］。根據藥典中獨活含有蛇床子素的下限值和片劑的生產工藝可知，該樣品中當歸原料可能混有的獨活量最高可達19%，超過雜質最大值（3%），說明該企業的當歸原料可能存在問題，采用混有較多獨活的當歸進行投料生產。

本研究采用的HPLC?MS／MS 法靈敏度高、專屬性強、分析速度快、樣品需要量少、樣品前處理簡單，能夠有效檢出龍膽瀉肝丸（片）中蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的含量情況，篩查當歸原料是否摻雜獨活，為龍膽瀉肝制劑整體質量的控制提供借鑒。