三葉青地上部分提取物對H22 荷瘤小鼠的抗轉移作用

王碧旭 盧靜靜孫棱程雯 周芳美 朱炳祺 丁志山?

（1.浙江中醫藥大學醫學技術與信息工程學院， 浙江 杭州310053； 2.浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江 杭州310053）

肝癌作為全球最常見的的十大惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率常年位居前列，全球約59%的新發病例分布于我國各地［1］。肝癌具有異質性強、潛伏期長、預后差等特點，大部分患者均于晚期被確診且發生遠端轉移，致其迅速死亡［2?3］。目前，肝移植、肝切除及血管介入等為常規治療方法，但易致患者預后不良［4?6］。中藥可通過多靶點、多環節發揮抗腫瘤作用，且毒副作用較小。三葉青Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg 為我國特有的葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物，其全草均可入藥，具有抗腫瘤、保肝護肺、調節免疫等藥理作用［7?10］，于2018 年被列為新“浙八味”。本研究旨在探討三葉青地上部分抗肝癌作用，篩選出其抗腫瘤主要藥效成分，以期為三葉青的進一步深入開發利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級BALB／c 雄性小鼠100只，體質量20～24 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2017?0005。

1.2 細胞株 小鼠肝癌H22 細胞株由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.3 試劑與藥物 三葉青地上部分均采自浙江省杭州市富陽區，經浙江中醫藥大學丁志山教授鑒定為正品。注射用環磷酰胺（德國 Baxter Oncology GmbH 公司，批 號7J196G）；TNF?α 試劑盒、IL?6 試劑盒、IFN?γ 試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號 20160627158、20160612056、20160302016）；IL?2 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號MM?43631M1）。其他試劑均為分析純。

1.4 儀器 凍干機（美國Labconco 公司，型號FreeZone 4.5）；體式顯微鏡（日本尼康公司，型號SMZ25）；恒溫CO2培養箱（美國Thermo Fisher 公司，型號Series ⅡWater Jacket）；微孔板酶標儀（美國BioTek 公司，型號Epoch2）。

2 方法

2.1 三葉青地上部分提取物的制備

2.1.1 三葉青地上部分醇提物 取適量干燥的三葉青地上部分打粉，過60 目篩，按料液比1∶15，加入95%乙醇冷凝回流2次，每次1.5 h，合并2 次濾液，旋轉蒸發至無乙醇味，制得醇提物，備用，收集濾渣。

2.1.2 三葉青地上部分多糖 取“2.1.1”項下濾渣按照料液比1∶15 加入雙蒸水，冷凝回流提取2次，每次1.5 h，減壓過濾，合并2 次濾液，旋轉蒸發，采用Sevag法去除蛋白部分，重復2次，旋轉蒸發除去有機試劑，減壓濃縮，緩慢加入3 倍體積95% 乙醇，充分混勻，靜置12 h，4 000 r／min離心10 min，收集沉淀，用無水乙醇反復洗脫沉淀2次，抽濾去除乙醇，將沉淀真空冷凍干燥后制得粗多糖組分，備用。

2.2 H22 荷瘤小鼠模型的建立 H22 細胞按常規方法培養后，取健康小鼠腹腔注射肝癌細胞懸液0.2 mL，1 周后小鼠腹部膨隆，無菌條件下抽取小鼠腹水，用無菌生理鹽水反復離心洗滌，調整細胞密度為1×108／mL，取0.05 mL 瘤細胞懸液接種于除空白組外其余小鼠左后肢爪墊內側皮下。

2.3 分組及給藥 將小鼠隨機分為空白組，模型組，玉米油組，環磷酰胺組（40 mg／kg），醇提物低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），每組10 只。環磷酰胺組作為陽性對照組，玉米油組作為陰性對照組；醇提物各劑量組小鼠灌胃給予用玉米油溶解的三葉青地上部分醇提物；多糖各劑量組小鼠灌胃給予用無菌生理鹽水溶解的三葉青地上部分多糖；環磷酰胺組小鼠隔天腹腔注射環磷酰胺；空白組、模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水；玉米油組小鼠灌胃給予等體積玉米油，每天1次，連續給藥21 d。

2.4 小鼠抑瘤率和臟器指數檢測 各組小鼠末次給藥后禁食24 h，脫頸處死，剝離瘤塊、脾臟、胸腺、肝臟組織，稱定質量并計算抑瘤率和臟器指數，公式為抑瘤率＝［（模型組平均瘤質量－給藥組平均瘤質量）／模型組平均瘤質量］ ×100%，臟器指數＝臟器平均質量／體質量×100%。

2.5 小鼠腫瘤遠端轉移灶檢測 剝離各組小鼠肺組織、右側腘窩、髂動脈旁、腎門處的淋巴結，用Bouin 液固定，48 h 后在體式顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤遠端轉移灶，并記錄轉移灶數。

2.6 ELISA 法檢測小鼠血清TNF?α、IL?6、IL?2、IFN?γ 水平 各組小鼠末次給藥后禁食24 h，摘眼球取血并處死，收集血液，3 000 r／min 離心10 min，分離得血清，嚴格按照相關試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清TNF?α、IL?6、IL?2、IFN?γ 水平。

2.7 HE 染色觀察小鼠腫瘤組織病理學變化 取各組小鼠剝離的瘤塊于4%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤組織病理學改變。

2.8 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件、Graphpad Prism 5.0 軟件進行處理，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 三葉青地上部分提取物對小鼠腫瘤生長的影響 與模型組、玉米油組比較，醇提物低劑量組小鼠瘤質量、瘤體積降低（P＜0.05），多糖各劑量組小鼠瘤質量、瘤體積降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，見表1、圖1。

圖1 三葉青地上部分提取物對小鼠腫瘤生長的影響（，n＝10）

表1 三葉青地上部分提取物對小鼠腫瘤生長的影響（n ＝10）

3.2 三葉青地上部分提取物對小鼠臟器指數的影響 與空白組比較，模型組小鼠脾臟、肝臟指數升高（P＜0.05），胸腺指數無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，玉米油組小鼠脾臟指數降低（P＜0.05），多糖各劑量組小鼠胸腺指數升高（P＜0.05），肝臟指數降低（P＜0.05），環磷酰胺組小鼠脾臟、胸腺指數均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與玉米油組比較，醇提物各劑量組小鼠各臟器指數均無明顯變化（P＞0.05）；與環磷酰胺組比較，多糖各劑量組和醇提物各劑量組小鼠胸腺指數升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 三葉青地上部分提取物對小鼠臟器指數的影響（，n＝10）

3.3 三葉青地上部分提取物對小鼠腫瘤遠端轉移的影響 小鼠經21 d 生長后，模型組小鼠腫瘤遠端肺轉移、淋巴道轉移情況嚴重，肺表面與淋巴結表面均出現不同級別的圓形小突起轉移結節。與模型組比較，環磷酰胺組和多糖各劑量組小鼠肺、淋巴道轉移灶數減少（P＜0.05，P＜0.01）；與玉米油組比較，醇提物低、中劑量組小鼠肺轉移灶數減少（P＜0.05，P＜0.01），見 圖3～4。

圖3 各組小鼠遠端肺（A，×6.3）、淋巴道（B，×12.6）轉移圖

圖4 三葉青地上部分提取物對H22 荷瘤小鼠腫瘤遠端肺、淋巴道轉移的影響（，n＝10）

3.4 三葉青地上部分提取物對小鼠血清TNF?α、IL?2、IFN?γ 水平的影響 與空白組比較，模型組、玉米油組小鼠血清TNF?α、IL?2、IFN?γ 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，多糖低劑量組小鼠血清IL?2 水平升高（P＜0.05），多糖中劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），多糖高劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ 水平升高（P＜0.01），環磷酰胺組小鼠血清TNF?α、IFN?γ 水平升高（P＜0.05）；與玉米油組比較，醇提物低劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2 水平升高（P＜0.05）；與環磷酰胺組比較，多糖低劑量組小鼠血清IL?6 水平升高（P＜0.05），多糖中劑量組小鼠血清IL?2、IL?6 水平升高（P＜0.01），多糖高劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ水平升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。

圖5 三葉青地上部分提取物對小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ 水平的影響（，n＝10）

3.5 三葉青地上部分提取物對小鼠腫瘤組織病理學的影響 模型組、玉米油組小鼠H22 腫瘤細胞排列紊亂、大小不一，細胞核清晰可見，生長旺盛且部分細胞呈侵襲性生長；環磷酰胺組小鼠腫瘤組織內部細胞生長受抑制且呈不規則變形，細胞數明顯減少；多糖各劑量組和醇提物各劑量組小鼠腫瘤細胞排列疏松，可見一定的細胞碎片和腫瘤細胞壞死區域，特別是多糖組腫瘤細胞壞死現象更為明顯，見圖6。

圖6 各組小鼠腫瘤組織病理HE 染色圖（×200）

4 討論

肝癌具有轉移速度快、惡性程度高、預后不良等特點，是我國腫瘤致死的第二大“元兇”［11?12］。迄今為止，放化療聯合應用仍然是治療肝癌最常用的方法，但其易導致患者機體乏力、骨髓抑制及局部皮膚損傷，亦能損傷機體免疫功能。三葉青作為臨床常用抗腫瘤藥物，含有多種藥用活性成分，前期對三葉青的研究多圍繞塊根及其醇提物類化合物抗腫瘤作用展開［13?15］，鮮有關于三葉青地上部分藥理作用的研究。然而，臨床上三葉青地上部分和塊根同樣使用，用藥方式為水煎服，水溶性成分中含量最高的為多糖，因此推測多糖是三葉青重要的藥效物質。

本研究通過建立H22 荷瘤小鼠模型，旨在探究三葉青地上部分各組分抗轉移作用。在小鼠整個腫瘤生長周期，多糖各劑量組小鼠腫瘤生長得到抑制，最高抑瘤率可達43.07%。郭菁菁等［16］研究發現，三葉青多糖可有效減少乳腺癌小鼠遠端肺轉移，抑制腫瘤細胞的轉移性，從而發揮抗腫瘤作用。本研究發現，與模型組比較，多糖各劑量組H22 荷瘤小鼠腫瘤遠端肺和淋巴道轉移均得到抑制，提示三葉青地上部分多糖可有效抑制腫瘤遠端轉移。環磷酰胺作為臨床廣泛使用的一種抗腫瘤藥物，藥效顯著，但極易導致機體免疫功能下降。與模型組比較，環磷酰胺組小鼠胸腺指數降低，而多糖各劑量組小鼠胸腺指數升高，提示多糖對免疫器官具有一定的保護作用。同時，腫瘤組織病理學結果顯示，三葉青地上部分多糖可顯著促進腫瘤細胞壞死。

細胞因子在惡性腫瘤發生、發展過程中至關重要，TNF?α、白細胞介素、IFN?γ 均能激活機體免疫應答，在抗腫瘤方面承擔著重要角色［17］。本研究發現，模型組小鼠血清TNF?α、IL?2、IFN?γ 水平低于空白組（P＜0.05）；而多糖組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ 水平高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），說明三葉青地上部分多糖可通過調節機體相關細胞因子水平而增強免疫功能。

綜上所述，本研究發現三葉青地上部分多糖具有良好的抗轉移作用，其可能是通過調節機體免疫應答、抑制腫瘤遠端轉移和促進腫瘤細胞壞死而發揮抑制腫瘤生長和抗轉移的作用。本研究初步證實三葉青地上部分具有與三葉青地下部分相同的抗腫瘤作用，為三葉青資源的開發利用奠定基礎，對三葉青的臨床應用與治療具有一定的指導意義。