白藜蘆醇對脂多糖誘導的BV2 細胞炎癥與凋亡反應的保護機制

陳二華 朱慧芳 譚東明 張建華丁旭殷紫?

（1.江蘇護理職業學院藥學與中藥學院， 江蘇 淮安223005； 2.江蘇護理職業學院護理與助產學院， 江蘇淮安223005）

神經炎癥是眾多神經退行性疾病的共同致病機制，中樞神經系統中原發與繼發性的傷害會導致多重的無菌損傷，并誘發細胞的凋亡、炎癥反應、神經功能障礙等［1］。小膠質細胞是中樞神經系統中先天免疫的第一道防線，在介導中樞神經炎癥的激活與繼發性損傷中起到關鍵作用，不僅可以釋放炎癥因子加重中樞神經的損傷，另一方面也可釋放營養因子從而減少炎癥對神經的損傷［2?3］。在中樞神經炎癥介導的眾多疾病中，抑制小膠質細胞的損傷，減少細胞凋亡等是減輕神經炎癥的一大重要策略。

白藜蘆醇作為目前臨床應用前景較好的多酚類化合物，在抑制細胞炎癥反應、減少細胞凋亡、影響細胞代謝、衰老、自噬等方面有重要作用［4?5］，但確切機制尚不明確。因此，本實驗建立了脂多糖刺激小鼠小膠質BV2 細胞系的炎癥模型，深入探討該成分發揮神經保護作用的機制，以期為后續臨床應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞 小鼠小膠質細胞BV2 細胞系（批號CL?0493），購自武漢普諾賽生命科技有限公司，培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養至融合度70%～80%時，傳代進行保種，或進行后續實驗。

1.2 試劑與藥物 白藜蘆醇（純度≥99%，批號R5010?100MG）、脂多糖（批號L4516）、細胞熒光染色Hoechst（批號B2261，1∶3 000）均購自美國Sigma?Aldrich 公司；DMSO（批號KGT5131）、DMEM（批號KGM12800?500）、RIPA 裂解液（批號KGP704）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號KGP903）均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；胎牛血清FBS（美國Gibco 公司，批號10100147）；3?甲基腺嘌呤（3?MA）（美國Selleck 公司，批號S2767）；磷酸酶抑制劑（美國Thermo Fisher 公司，批號78426）；兔抗Bax（美國Proteintech 公司，批號50599?2?Ig）；兔抗Bcl?2（南京巴傲得生物科技有限公司，批號BS1511）；鼠抗GAPDH（美國Santa Cruz 公司，批號sc?32233）；兔抗LC3B（批號2775）、兔抗SQSTM1（批號5114s）、兔抗TLR4（批號14358s）、兔抗FOXO3（批號2497s）、兔抗P?FOXO3（批號9466s）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；二抗辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠lgG（H＋L）（批號bs?40296G?HRP）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔lgG（H＋L）（批號bs?40295G?HRP）均購自北京博奧森生物技術有限公司；Lyso Tracker Red（批號1583088，1∶2 000）、mRNA提取Trizol（批號15596026）均購自美國Invitrogen 公司；HiScript ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（批號R233?01）、ChamQ qPCR SYBR Green MasterMix（批號Q121?02）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 儀器 細胞培養箱、冷凍離心機、雙波長酶標儀、熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電泳電轉儀（美國Bio?Rad 公司）；LAS 顯影儀（日本富士公司）；尼康共聚焦顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 給藥與分組 細胞按“1.1”項下方法培養后，先加入白藜蘆醇（結合前期研究與實驗結果［6］，設定能有效抑制炎癥反應的濃度為30 μmol／L）預處理30 min，再給予100 ng／mL 脂多糖刺激6 h，3?甲基腺嘌呤在脂多糖刺激5 h時給予處理1 h，現配現用，終濃度為5 mmol／L。再隨機分為對照組（不完全培養基培養，不做其他處理）、脂多糖組（100 ng／mL）、白藜蘆醇組（30 μmol／L）、脂多糖＋白藜蘆醇組（100 ng／mL＋30 μmol／L）、脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組（100 ng／mL＋30 μmol／L＋5 mmol／L）。

2.2 Western blot 法檢測蛋白表達 用含有磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解BV2 細胞，置于冰上裂解15 min 后刮取蛋白，16 000×g離心15 min，吸取上清后進行蛋白定量，加入5×Loading Buffer，在95 ℃下煮沸5 min，即得蛋白樣本。電泳儀分離蛋白分子，電轉移將蛋白分子轉移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1 h，4 ℃過夜孵育一抗，隔天棄去一抗，TBST 洗膜3次，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜后顯影曝光。

2.3 RT?qPCR 法檢測炎癥因子mRNA 表達 PBS 漂洗12孔板中的BV2 細胞，吸棄廢液后加入TRIzol，置于冰上裂解5 min，將TRIzol 溶液轉移至1.5 mL EP 管中，加入三氯甲烷，4 ℃、12 000×g離心15 min，將上層液體轉移至全新無酶RNA EP 管中，加入異丙醇于－20 ℃下靜置1 h，4 ℃、12 000×g離心15 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，揮干乙醇后加入DEPC 水溶解RNA。使用反轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，程序為42 ℃2 min，50 ℃15 min，80 ℃5 s，所得cDNA 樣品進行熒光定量PCR 檢測。反應體系為cDNA 1 μL，正、反向引物各0.5 μL，雙蒸水3 μL，ChamQ qPCR SYBR Green MasterMix 5 μL，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 細胞溶酶體Lyso tracker Red 染色 將接種于24 孔板中細胞爬片上BV2 細胞用Lyso tracker Red（DMEM，1∶2 000）染色30 min 后（37 ℃、5% CO2），將混有染料的DMEM 溶液吸棄，用4% 多聚甲醛溶液固定細胞15 min，PBS 輕輕洗滌細胞爬片，Hoechst 染核10 min，PBS 輕輕洗滌細胞爬片后倒扣在載玻片上，用防熒光猝滅劑封片，在顯微鏡下拍攝。

2.5 統計學分析 通過GraphPad Prism 7.0 軟件進行處理，數據均以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 白藜蘆醇對BV2 細胞凋亡蛋白表達的影響 與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組BV2 細胞Bax 蛋白表達降低（P＜0.05），Bcl?2 蛋白表達升高（P＜0.01），表明白藜蘆醇能改善由脂多糖引起的BV2 細胞凋亡反應，見圖1。

圖1 白藜蘆醇對BV2 細胞凋亡蛋白表達的影響（，n＝3）

3.2 白藜蘆醇對BV2 細胞狀態的影響 對照組、白藜蘆醇組BV2 細胞形態呈圓形，細胞有較少的分支突起；脂多糖組BV2 細胞圓形結構遭到破壞，細胞有明顯觸角，為激活樣狀態；脂多糖＋白藜蘆醇組能緩解BV2 細胞的激活，表現為炎癥因子的釋放而介導神經炎性作用，表明白藜蘆醇可緩解脂多糖引起的BV2 細胞激活，見圖2。

圖2 各組BV2 細胞的狀態

3.3 白藜蘆醇對BV2 細胞炎癥因子mRNA 表達的影響 與對照組比較，脂多糖組BV2 細胞中IL?6、IL?1、TNF?αmRNA 表達升高（P＜0.01）；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組BV2 細胞中IL?6、IL?1、TNF?αmRNA 表達降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 白藜蘆醇對BV2 細胞炎癥因子mRNA 表達的影響（，n＝6）

3.4 白藜蘆醇對BV2 自噬阻滯的影響 細胞凋亡現象可能因其細胞自噬受阻而導致［7］。與對照組比較，脂多糖組BV2 細胞中SQSTM1 蛋白表達升高（P＜0.01），LC3?Ⅱ／LC3?Ⅰ比值降低（P＜0.05），提示脂多糖可引發細胞自噬的阻滯；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組細胞中SQSTM1 蛋白表達降低（P＜0.05），LC3?Ⅱ／LC3?Ⅰ比值升高（P＜0.05），提示白藜蘆醇能緩解脂多糖引起的自噬阻滯；與脂多糖＋白藜蘆醇組比較，脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組BV2 細胞中SQSTM1 蛋白表達升高（P＜0.05），LC3?Ⅱ／LC3?Ⅰ比值降低（P＜0.05），表明自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤可消除白藜蘆醇的促自噬作用，見圖4。

圖4 白藜蘆醇對BV2 自噬阻滯現象的影響（，n＝3）

3.5 白藜蘆醇對BV2 細胞自噬?溶酶體損傷阻滯的影響與對照組比較，脂多糖組能引起自噬?溶酶體通路中溶酶體細胞器的損傷，表現為細胞器熒光信號的減弱，而白藜蘆醇組可有效降低脂多糖對BV2 的損傷；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組則有效提高了溶酶體細胞器的熒光強度，降低損傷；與脂多糖＋白藜蘆醇組比較，脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組可消除白藜蘆醇的作用，增加溶酶體的損傷阻滯，見圖5。

圖5 各組BV2 細胞自噬?溶酶體損傷阻滯現象（×40）

3.6 白藜蘆醇對BV2 細胞凋亡與炎癥相關蛋白表達的影響 TLR4 受體介導的哺乳動物FOXO3 轉錄因子的磷酸化上調是LPS 引發自噬的重要機制［8］。與對照組比較，脂多糖組TLR4 蛋白表達、FOXO3 磷酸化水平升高（P＜0.01）；與脂多糖組比較，脂多糖＋白藜蘆醇組TLR4 蛋白表達、FOXO3 磷酸化水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與脂多糖＋白藜蘆醇組比較，脂多糖＋白藜蘆醇＋3?甲基腺嘌呤組TLR4蛋白表達、FOXO3 磷酸化水平升高（P＜0.05，P＜0.01），表明自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤消除了白藜蘆醇的作用，見圖6。

圖6 白藜蘆醇對BV2 細胞凋亡與炎癥相關蛋白表達的影響（，n＝3）

4 討論

神經退行性疾病的發病起始階段，炎癥反應起到保護和修復組織的作用，而持續的炎癥反應則會引起小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元細胞的凋亡損傷、自噬功能缺陷［9?11］。小膠質細胞的激活是神經炎癥的主要特征，激活的小膠質細胞可介導各種神經毒性物質以及促炎因子的釋放并導致神經元細胞的死亡。生理條件下，小膠質細胞主要負責免疫監視與宿主的防御感染，但在神經炎性條件下，小膠質細胞的異常激活會釋放各種神經毒性物質如興奮性谷氨酸、奎寧酸、組胺等從而導致腦組織的損傷。雖然短期的小膠質細胞活化是有神經保護效應，但長期的活化已被認為是神經退行性疾病的潛在機制。因此，基于小膠質細胞功能以獲得安全有效的神經保護劑很重要。

白藜蘆醇來源于虎杖、葡萄等，研究表明其能降低心血管系統疾病的發病率［12］，并且在脂多糖誘導的神經炎癥模型中，可通過過氧化物酶體增殖物激活受體?γ 共激活因子?1α 減輕炎癥損傷促進小膠質細胞向M2 型轉化［13］。白藜蘆醇能影響細胞自噬的關鍵通路，例如調控雷帕霉素靶蛋白的磷酸化程度，從而影響細胞的糖酵解過程［14］；通過抑制絲裂原誘導的核糖體p70S6K 激酶磷酸化影響大鼠主動脈平滑肌細胞肥大［15］。在中樞神經系統中，白藜蘆醇也可通過調控自噬過程來提高神經系統的穩定性，免受氧化應激的損傷［4，16］。本研究發現，白藜蘆醇有效減輕了脂多糖引起的自噬阻滯，并減少了溶酶體細胞器的損傷，從而減少了BV2 細胞的凋亡與炎癥因子IL?6、IL?1、TNF?αmRNA表達。

脂多糖是對小膠質細胞激活最為有效的刺激物之一，脂多糖刺激小膠質細胞后，通過膜上的TLR4 受體介導下游的免疫應答［17］。FOXO3 是FOXO 家族的重要成員，因其廣泛參與調控泛素?蛋白酶體和自噬?溶酶體蛋白水解途徑，是蛋白分解的關鍵調節劑［18］。自噬?溶酶體途徑是維持細胞自身代謝以及蛋白質更新的重要過程，自噬過程的順利進行有利于細胞受損成分的清除與細胞內物質的降解，以便在饑餓以及壓力環境下提供能量。既往研究與本研究證實，白藜蘆醇能有效減輕脂多糖引起的自噬?溶酶體通路障礙［19］，通過進一步研究發現，白藜蘆醇可通過TLR4?FOXO3 通路有效減輕自噬的阻滯現象。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過TLR4?FOXO3 信號通路減弱脂多糖引發的自噬?溶酶體的通路障礙，并減少BV2 細胞的凋亡與炎癥因子的釋放。