治療陰道炎中藥方劑的篩選和優化

穆阿寧 梁引庫 李云祥劉旭

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院， 陜西 漢中723000； 2.陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中723000）

陰道炎是一種常見的陰道黏膜、黏膜結締組織發炎的疾病，也是患病率較高的婦科疾病之一，易引起宮頸炎，嚴重時會感染盆腔、上生殖道、腹腔［1］。治療陰道炎的抗生素較多，如硝基咪唑類、氟喹諾酮類等治療細菌性陰道炎［2］，咪唑類、三唑類等治療念珠性陰道炎，甲硝唑、替硝唑、硝基咪唑類治療滴蟲性陰道炎［3］，雖然見效快，時間短，但也存在一定局限性［4］，易產生耐藥性，導致病情反復發作，困擾患者正常生活［5］。

隨著社會發展，人們面臨病菌威脅的形勢越來越嚴峻，加上其自身變異后會產生耐藥性，導致現有抗生素逐漸失去原有效果［6］。研究表明，病菌耐藥性、抗藥性主要體現在對某一種或幾種抗菌藥物的耐藥作用，但是當多種藥物聯合作用時則能有效抑制其生長［7］，故多重抗菌藥物正成為現今研究的熱點內容，其中中藥復方制劑是主要方向。因此，本實驗篩選治療陰道炎的中藥方劑，并進行優化，以期為開發相關制劑提供依據。

1 材料

1.1 藥材 蒲公英、五倍子、苦參、黃連、夏枯草、黃芩均購自陜西省漢中市陜西美致惠健康大藥房連鎖有限公司，經陜西理工大學李新生教授鑒定為正品。

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌（批號ATCC25925）、白色念珠菌（批號ATCC10231）、加德納桿菌（批號ATCC14018），由陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室提供，置于－80 ℃低溫冰箱中冷凍保存，實驗前復蘇傳代。

1.3 試劑與藥物 瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖購自北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉購自天津市盛奧化學試劑有限公司；石油醚購自天津市光復科技發展有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚購自天津市富宇精細化工有限公司；二甲基亞砜購自天津市博迪化工有限公司；無菌輔酶I、HTM 基礎培養基購自上海瑞楚生物科技有限公司；7 mm 無菌紙片為自制。

1.4 儀器 HC?250 型搖擺式粉碎機購自永康市天祺盛世工貿有限公司；DHG?9203A 型真空干燥箱購自上海精宏實驗設備有限公司；2XZ 型旋片式真空泵購自臨海市譚氏真空設備有限公司；HH?S4 型電熱恒溫水浴鍋購自北京科偉永興儀器有限公司；FA2204B 型電子天平購自上海精密科學儀器有限公司；UV2550 型分光光度計購自日本島津公司；DHP?9162 型電熱恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；SW?CJ?1D 型單人超凈工作臺購自上海蘇凈實業有限公司。

2 方法與結果

2.1 文獻檢索與分析 在CNKI 數據庫中以“白色念珠菌”“加德納桿菌”“金黃色葡萄球菌”為研究對象，“中藥”“需氧細菌性陰道炎”“細菌性陰道炎”“霉菌性陰道炎”為關鍵詞，初步篩選具有抗菌作用的中藥，作為中藥方劑候選復方組分。結果，對陰道炎有抑制作用的中藥有123種，并且活性成分種類很多，包括生物堿、黃酮、苯丙素、揮發油等［8］，其中對白色念珠菌、加德納桿菌、金黃色葡萄球菌有效果者見表1［9?23］。

表1 對陰道炎相關致病菌有抑制作用的中藥

由此可知，黃芩對白色念珠菌的抑制效果優于其他中藥；苦參、黃芩對加德納桿菌表現為高敏感性；夏枯草、五倍子、黃連抑制金黃色葡萄球菌生長能力最強。前期研究發現，蒲公英所含酚類成分對白色念珠菌、加德納桿菌的抑制作用較強，其機制與破壞兩者生物膜有關［24］。因此，初步將蒲公英、黃芩、苦參、夏枯草、五倍子、黃連作為中藥方劑候選組分。

2.2 提取物制備 將“2.1”項下6 種中藥方劑候選組分在70 ℃下干燥至恒重，粉碎機粉碎后過60 目篩，稱取適量粉末，按照比例分別加入水、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚進行提取，即得，置于60 ℃真空干燥箱中揮盡水分得到浸膏，在4 ℃下保存。

2.3 中藥方劑組分篩選 采用紙片抑菌法考察“2.2”項下提取物（質量濃度均為100 mg／mL）對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、加德納桿菌的抑制作用，測定抑菌圈直徑，空白對照組紙片滴加相應藥物溶劑［8］，結果見表2～4。

表2 提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用

由此可知，黃連醇提物對白色念珠菌的抑制能力最強，對金黃色葡萄球菌也有較強作用；五倍子水提物對金黃色葡萄球菌、加德納桿菌的抑制能力較強；苦參乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、加德納桿菌的抑制能力最強；蒲公英乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、加德納桿菌的抑制能力較強；黃芩水提物、醇提物、乙酸乙酯提取物及夏枯草水提物、醇提物對3 種致病菌均有一定抑制能力，但均不突出。綜上所述，黃連醇提物、五倍子水提物、苦參乙酸乙酯提取物、蒲公英乙酸乙酯提取物具有良好的抑菌作用。

表4 提取物對加德納桿菌的抑制作用

2.4 最小抑菌濃度測定 將活化好的3 種致病菌調至最佳吸光度作為指示菌，其中金黃色葡萄球菌接種于LB 液體培養基，白色念珠菌接種于沙氏液體培養基，加德納桿菌接種于HTM 液體培養基，再配制256 mg／mL 提取物母液，接入5%調好濃度的菌懸液，37 ℃、200 r／min 培養24 h。設置對照組質量濃度0 mg／mL，以藥物組試管內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。另外，由于中藥顏色和提取物渾濁度的影響，故采用無菌接種環充分蘸取對應管中液體，轉涂于相應培養基時后，在37 ℃下過夜培養12 h，劃線處無細菌生長時確定為MIC。

采用倍比稀釋法［25］測定“2.3”項下4 種提取物對致病菌的MIC，結果見表5。由此可知，黃連醇提物對白色念珠菌的抑制能力最強；苦參乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、加德納菌的抑制能力最強；蒲公英乙酸乙酯提取物對3 種致病菌均有一定抑制能力，但均不突出；五倍子水提物對白色念珠菌的抑制能力較弱。

表5 提取物對致病菌的MIC

2.5 正交試驗 選擇“2.4”項下抑菌效果顯著（MIC 較低）的提取物，按照正交表L9（34）配成中藥方劑，以蒲公英乙酸乙酯提取物質量濃度（A）、五倍子水提物質量濃度（B）、苦參乙酸乙酯提取物質量濃度（C）、黃連醇提物質量濃度（D）為影響因素，課題組前期研究發現，加入0.25、0.5、0.75 倍MIC 蒲公英提取物后，加德納桿菌細胞膜遭到破壞，細胞通透性增強［8］，故每個因素設置3個水平，分別為1、0.5、0.25 倍MIC，并以抑菌圈直徑（Y）為評價指標，采用正交試驗［26］優化配方。

2.5.1 加德納桿菌 因素水平見表6，結果見表7，可知各因素影響程度依次為C＞A＞B＞D。方差分析見表8，可知因素A、B、C有顯著影響（P＜0.01），而D無顯著影響（P＞0.05）。最終確定，最優配方為A3B2C1D2，即8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 五倍子水提物、16 mg／mL苦參乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黃連醇提物（四者質量濃度比例為1∶2∶2∶2）。

表6 對加德納桿菌抑制作用的因素水平

表7 對加德納桿菌抑制作用的試驗設計與結果

表8 對加德納桿菌抑制作用的方差分析

2.5.2 金黃色葡萄球菌 因素水平見表9，結果見表10，可知各因素影響程度依次為D＞B＞C＞A。方差分析見表11，可知各因素均有顯著影響（P＜0.01）。最終確定，最優配方為A1B1C1D3，即16 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、16 mg／mL五倍子水提物、2 mg／mL 苦參乙酸乙酯提取物、4 mg／mL 黃連醇提物（四者質量濃度比例為8∶8∶1∶2）。

表9 對金黃色葡萄球菌抑制作用的因素水平

表10 對金黃色葡萄球菌抑制作用的試驗設計與結果

表11 對金黃色葡萄球菌抑制作用的方差分析

2.5.3 白色念珠菌 因素水平見表12，結果見表13，可知各因素影響程度依次為C＞B＞D＞A。方差分析見表14，可知各因素均有顯著影響（P＜0.01）。最終確定，最優配方為A3B2C1D1，即8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、32 mg／mL五倍子水提物、32 mg／mL 苦參乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黃連醇提物（四者質量濃度比例為1∶4∶4∶2）。

表12 對白色念珠菌抑制作用的因素水平

表13 對白色念珠菌抑制作用的試驗設計與結果

表14 對白色念珠菌抑制作用的方差分析

2.6 抑菌作用篩選 分別將“2.5.1”“2.5.2”“2.5.3”項下優化配方命名為配方1、配方2、配方3，其抑制效果見圖1。再以抑菌圈直徑為指標，將抑菌能力最弱的配方2分別與配方1、配方3 進行組間方差分析，結果見圖2。

圖1 各配方對致病菌的抑制效果

圖2 各配方抑菌圈直徑

由此可知，指示菌為金黃色葡萄球菌時，與配方2 比較，配方1 抑菌圈直徑無顯著差異（P＞0.05），表明兩者抑菌作用相當；配方3 抑菌圈直徑增大（P＜0.01），達14.67 mm，表明其抑菌作用最強。指示菌為加德納桿菌時，與配方2 比較，配方1、配方3 抑菌圈直徑無顯著差異（P＞0.05），表明三者抑菌作用相當。指示菌為白色念珠菌時，與配方2 比較，配方1 抑菌圈直徑無顯著差異（P＞0.05），表明兩者抑菌作用相當；配方3 抑菌圈直徑增大（P＜0.05），表明其抑菌作用最強。綜上所述，配方3 為治療陰道炎的最佳中藥方劑。

3 討論與結論

陰道炎按疾病起因分類，需氧性細菌陰道炎、厭氧性細菌陰道炎、霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎占據總數的90%，其中需氧性細菌陰道炎主要由需氧性細菌引起，常見的有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈霉菌等；厭氧性細菌陰道炎在成年女性中最容易發生，主要由厭氧性細菌引起，乳酸桿菌菌群減少或缺失導致陰道pH 值上升，引起加德納菌屬大量繁殖，進而導致陰道黏膜發生炎癥；霉菌性陰道炎主要由假絲酵母菌引起，其中白色念珠菌是最主要的感染細菌，其感染陰道時可引起外陰、陰道瘙癢，近年來抗生素大量使用導致陰道內環境酸堿度上調，為該病菌增殖提供了條件，進而導致陰道疾病反復發作。因此，本實驗選取金黃色葡萄球菌、加德納桿菌、白色念珠菌作為病原菌，篩選治療陰道炎的中藥方劑。

在前期蒲公英提取物研究的基礎上，本實驗通過文獻調研篩選出6 味中藥，分別為黃連、五倍子、黃芩、夏枯草、苦參、蒲公英，通過紙片抑菌法確定蒲公英乙酸乙酯提取物、五倍子水提物、苦參乙酸乙酯提取物、黃連醇提物對金黃色葡萄球菌、加德納桿菌、白色念珠菌具有良好的抑制效果，其中黃連醇提物抑制白色念珠菌的作用顯著優于其他三者，蒲公英、苦參乙酸乙酯提取物及五倍子水提物對加德納菌的抑制能力顯著高于黃連醇提物。采用正交試驗優化配方，得到配方1～3，對抑制上述3 種致病菌各有優勢，其中配方3 效果最突出，其組成為8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、32 mg／mL 五倍子水提物、32 mg／mL苦參乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黃連醇提物（即四者質量濃度比例為1∶4∶4∶2），它通過不同中藥之間的復配關系來增強藥效，以達到安全、低毒、經濟的目的，可為開發新型治療陰道炎的藥物提供思路。