桑寄生不同提取部位對黃嘌呤氧化酶的體外抑制活性

梁 圓 蔡毅朱意麟盧小慧鐘夏瑜黎理

（1.廣西中醫(yī)藥大學， 廣西 南寧530200； 2.玉林市第一人民醫(yī)院， 廣西 玉林537099； 3.成都中醫(yī)藥大學， 四川 成都611137）

痛風是人體嘌呤代謝異常所致的一組綜合癥，由尿酸鹽晶體聚積關(guān)節(jié)而引起［1］。現(xiàn)治療痛風多以黃嘌呤氧化酶為切入點，該酶為尿酸生成的關(guān)鍵代謝酶。長期服用別嘌醇可能會引起過敏、肝腎損傷及骨髓抑制等不良反應，限制了其臨床應用。中醫(yī)認為“痛風”屬于痹證或者痹病的范疇［2］，由于風寒濕邪、風濕熱邪痹阻經(jīng)絡導致氣血運行不暢，或者是由于痰濁、瘀血阻滯經(jīng)絡所導致的，應及時采用祛風濕藥來祛風通絡、祛邪外出。同時因中藥具有毒副作用低、多靶點、多組分的特點，適合以此尋找治療痛風的天然活性物質(zhì)。

桑寄生為桑寄生科桑寄生Taxillus chinensis（DC.）Danser 的干燥帶葉莖枝［3?4］。桑寄生及其配伍復方對于治療肝腎氣血不足、不榮所致疼痛或外感風寒濕熱等邪氣所致的腰痛、痹證等肢體經(jīng)絡系常見病證具有良好的療效，還具有提高軟骨活力的作用［5?6］。同科植物紅花寄生的提取物能一定程度緩解由尿酸鈉所導致的急性痛風性關(guān)節(jié)炎，但對于桑寄生治療痛風相關(guān)疾病的研究尚未見報道［7］。本研究采用紫外分光光度法結(jié)合高效液相色譜法以考察不同寄主的桑寄生藥材不同提取部位對黃嘌呤氧化酶的體外抑制作用，為擴大桑寄生藥用價值提供參考。

1 材料

桑寄生，共13 批藥材，以桑樹為寄主的藥材分別采自廣西梧州市安平鎮(zhèn)富寧村、南寧市興寧區(qū)藥用植物園、河池市天蛾縣、玉林市興業(yè)縣石南鎮(zhèn)；以楓香樹、黃皮樹、大葉冬青樹、山楂樹和龍眼樹為寄主的藥材采自梧州市安平鎮(zhèn)；以桃樹和桂花樹為寄主的藥材采自南寧市西鄉(xiāng)塘；以樟樹為寄主的藥材采自廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院；以松樹為寄主的藥材采自百色市樂業(yè)縣，自然陰干，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院蔡毅教授鑒定為桑寄生科鈍果寄生屬植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.）Danser 的干燥帶葉莖枝。

磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號20 201201；黃嘌呤、尿酸、別嘌醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號分別為E2008048、H1710084、L2 001123；二甲基亞楓（DMSO）、黃嘌呤氧化酶（XO），北京索萊寶科技有限公司，批號分別為1121E0316、227U013；磷酸二氫鉀試劑為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸、石油醚（60～90 ℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇等試劑均為分析純；水為純水。

ES2220M 型電子天平，瑞士普利賽斯公司；5810R 型冷凍離心機，德國艾本德公司；HWS?26型恒溫水浴鍋、ALPHA1?2LD plus 型冷凍干燥機，德國博勵行公司；UV?2600 型可見光紫外分光光度計，日本島津公司；e2695 型高效液相色譜儀，美國沃特世公司。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 提取物 取各批次桑寄生藥材（葉、枝為2∶1），打粉，加入10、8、6 倍量60% 乙醇，各回流提取2 h，合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，溶于熱水中，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇分別進行萃取，得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各部位減壓濃縮、冷凍干燥，得到粉末，在陰涼處保存。

2.1.2 供試品 精密稱取桑寄生各提取部位粉末適量，加入PBS（含1% DMSO），超聲溶解，得4 000 μg／mL 溶液，用含1% DMSO 的PBS 進行稀釋，得4 000、2 000、1 000、500、250、125 μg／mL的供試品。

2.1.3 酶溶液 取5 U／460 μL 的黃嘌呤氧化酶溶液適量，加入純水稀釋，得10、12.5、25、50、100、150、200、250、300 U／L 酶溶液，分裝至EP 管中，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 黃嘌呤底物溶液 精密稱取黃嘌呤粉末適量，置于50 mL 量瓶中，加入1 mol／L 氫氧化鈉適量，超聲溶解，最后加入純水定容至刻度線，得到1.2 mmol／L 底物貯備液，分裝至EP 管中，于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5 尿酸溶液 精密稱取尿酸粉末適量，置于25 mL 量瓶中，加入少量PBS，超聲溶解，得0.59 mmol／L尿酸對照品溶液。

2.2 反應體系建立

2.2.1 紫外反應體系 設定總反應體系為5 mL。樣品組加入各供試品0.2 mL、PBS 2.3 mL、黃嘌呤溶液2.0 mL、黃嘌呤氧化酶溶液0.5 mL以啟動反應；以不加黃嘌呤氧化酶溶液作為空白組；以不加供試品溶液為陽性對照組；以不加供試品和黃嘌呤氧化酶溶液作為陰性對照組［8］。

2.2.2 高效液相反應體系 流動相為含1% 甲醇的0.02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液；洗脫時間15 min；體積流量1.0 mL／min；柱 溫25 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。樣品組加入各供試品0.2 mL、PBS 1.3 mL、黃嘌呤溶液2.0 mL、黃嘌呤氧化酶溶液0.5 mL 以啟動反應，反應30 min 后加入1 mol／L鹽酸中止反應；以不加黃嘌呤氧化酶溶液作為空白組；以不加供試品溶液為陽性對照組；以不加供試品和黃嘌呤氧化酶溶液作為陰性對照組［9］。

2.3 酶活力測定 在“2.2.1”項紫外反應體系中，向試管中加入2.5 mL PBS溶液、2 mL 1.2 mmol／L黃嘌呤溶液，將試管置于25 ℃水浴20 min，加入0.5 mL 50 U／L 黃嘌呤氧化酶溶液，混勻，迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中，于紫外分光光度計在200～800 nm 波長處進行掃描，確定尿酸產(chǎn)物特征吸收波長。在同一反應體系中，加入0.5 mL 不同濃度的黃嘌呤氧化酶溶液（10、12.5、25、50、100、150、200、250、300 U／L）以啟動反應，酶加入的時間為0 s，每隔1 s 測定吸光度，連續(xù)測定10 min，平行測定3 次。單位時間內(nèi)吸光度增長越大，說明酶的活性越高，以此篩選酶最佳反應濃度。

2.4 反應速率測定 在“2.2.1”項紫外反應體系中，取各供試品（160、80、40、20、10 μg／mL）、2.3 mL PBS 溶液，2 mL 黃嘌呤底物溶液，于25 ℃水浴20 min 后加入0.5 mL 黃嘌呤氧化酶溶液以啟動反應，測定其反應速率。

2.5 黃嘌呤氧化酶抑制率及IC50測定 在“2.2.2”

項高效液相反應體系中，樣品組加入各提取部位溶液（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg／mL）或別嘌醇溶液（50.00、25.00、12.50、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195 μg／mL），再加入0.5 mL 黃嘌呤氧化酶溶液以啟動反應，在25 ℃反應30 min后，加入1 mL 1 mol／L鹽酸以終止反應。同時制備空白組、陽性對照組和陰性對照組溶液，各取10 μL 進行分析，采用SPSS 20.0 軟件計算抑制率及IC50。

2.6 有效部位抑制類型判斷 在“2.2.1”項紫外反應體系中，保持黃嘌呤溶液濃度不變，測定黃嘌呤氧化酶溶液為0.025、0.05、0.10、0.20 U／mL時，不同提取部位各質(zhì)量濃度（1.0、2.0、4.0 mg／mL）對酶促反應速率的影響。以黃嘌呤氧化酶濃度為橫坐標（X），反應速率為縱坐標（Y），判斷有效部位對黃嘌呤氧化酶是否為可逆抑制。

3 結(jié)果

3.1 檢測波長的確定 按“2.3”項下方法操作，制備溶液并轉(zhuǎn)移至比色皿中，在紫外分光光度計中進行多次檢測，根據(jù)結(jié)果選定291 nm 作為尿酸檢測波長。

3.2 方法學考察 在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，黃嘌呤底物與尿酸產(chǎn)物的保留時間分別為13.1、8.2 min，與其他組分分離度均大于1.5，峰型良好。其中黃嘌呤底物分離度最高，影響最小，故通過測定黃嘌呤的消耗量，以此來反映黃嘌呤氧化酶的活性，見圖1。分別吸取適量1.0 mmol／L黃嘌呤溶液進樣，重復測定3次，得到標準曲線方程為Y＝1 579 588X－4 634，R2＝0.999 8，表明黃嘌呤在0.239～7.66 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取1.915 mg／mL 黃嘌呤溶液連續(xù)進樣測定6次，測得峰面積RSD 為0.21%，表明精密度良好。取1.915 mg／mL 黃嘌呤溶液，每隔2 h 進樣測定1次，共7次，測得峰面積RSD 為0.92%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密吸取3.125 μg／mL別嘌醇溶液，按“2.2.2”項反應體系平行制備6組，測定黃嘌呤峰面積，得質(zhì)量濃度為3.30 mg／mL，RSD 為1.8%，表明重復性良 好。精密吸取3.125 μg／mL別嘌醇溶液，按“2.2.2”項反應體系加入2 倍黃嘌呤溶液，平行制備6組，測定黃嘌呤峰面積，得平均回收率為101.3%，RSD 為2.1%。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 黃嘌呤氧化酶最佳反應濃度確定 在紫外反應體系中，相同的底物濃度下，不同的黃嘌呤氧化酶濃度其反應速率各不相同，可見隨著黃嘌呤氧化酶濃度的增加，酶促反應初速度提高，其初速度和酶濃度呈正相關(guān)。當體系中黃嘌呤氧化酶濃度為10、12.5、25 U／L時，反應1 min 后速率趨向于零，可能因為黃嘌呤氧化酶濃度較低，與黃嘌呤底物反應后迅速失活導致。當黃嘌呤氧化酶濃度為200、250 U／L時，隨著反應時間推移，反應速率顯著降低，可能是由于黃嘌呤氧化酶濃度偏高，體系中底物消耗，導致速率降低。當體系中黃嘌呤氧化酶濃度為50、100、150、200 U／L時，反應速率都具有下降的趨勢，但其中黃嘌呤氧化酶濃度為50 U／L 時的前5 min，變化幅度最小，因此用該條件進行下一步研究，見圖2。

圖2 黃嘌呤氧化酶濃度對反應速率的影響Fig.2 Effects of xanthine oxidase concentration on reaction rate

3.4 各提取部位對反應速率的影響 在黃嘌呤氧化酶濃度為50 U／L 的紫外反應體系中，加入桑寄生各提取部位，測定5 min 內(nèi)平均反應速率，見圖3。隨著桑寄生質(zhì)量濃度的增加，酶促反應速率均有不同程度的降低，說明各提取部位對黃嘌呤氧化酶抑制作用呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。其中乙酸乙酯和正丁醇部位為6.25～100 μg／mL時，酶促反應速率顯著降低，為100～200 μg／mL 時反應速率趨于平穩(wěn)；石油醚和三氯甲烷部位對反應速率的影響較小。

圖3 提取部位對反應速率的影響Fig.3 Effects of extraction site on reaction rate

3.5 各提取部位對抑制率影響 隨著桑寄生質(zhì)量濃度的增加，其對黃嘌呤氧化酶的抑制率不斷升高，說明對黃嘌呤氧化酶的抑制作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，見表1。當質(zhì)量濃度為0～100 μg／mL時，乙酸乙酯和正丁醇部位抑制率增長，為100 μg／mL時抑制率超過50%；其余部位對黃嘌呤氧化酶的抑制率較低。由表1 可知，石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的IC50分別為338、466、73、67、1 424 μg／mL，可見乙酸乙酯和正丁醇部位的IC50遠低于其他部位，因此選取乙酸乙酯部位和正丁醇部位進行后續(xù)實驗。

表1 不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.1 Inhibition rates of different extraction sites（，n＝3）

表1 不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.1 Inhibition rates of different extraction sites（，n＝3）

3.6 乙酸乙酯和正丁醇部位對黃嘌呤氧化酶抑制率的影響 桑樹為寄主的桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位的IC50均小于100 μg／mL，其中當各樣品質(zhì)量濃度大于100 μg／mL時，抑制率均大于50%。南寧產(chǎn)地的桑寄生乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度為200 μg／mL時，抑制率超過90%，其IC50值最小，為32.18 μg／mL；以河池產(chǎn)地的桑寄生正丁醇部位IC50值最高，為99.67 μg／mL。測定9 批不同寄主的桑寄生藥材乙酸乙酯和正丁醇部位對黃嘌呤氧化酶的抑制率，結(jié)果得楓樹上的桑寄生正丁醇部位質(zhì)量濃度為200 μg／mL時，抑制率超過90%；其乙酸乙酯部位IC50值最低，為44.68 μg／mL。此外，除桑樹、楓樹、黃皮樹上的桑寄生正丁醇部位和桃樹、大葉冬青上的桑寄生乙酸乙酯部位外，其余寄主上的桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位IC50均大于100 μg／mL，見表2～3。

表2 不同產(chǎn)地桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.2 Inhibition rates of different extraction sites from different origin of Taxilli Herba（，n＝3）

表2 不同產(chǎn)地桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.2 Inhibition rates of different extraction sites from different origin of Taxilli Herba（，n＝3）

3.7 黃嘌呤氧化酶抑制類型 圖4 中各直線基本相交于原點，表明桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位對黃嘌呤氧化酶的抑制作用為可逆性抑制。

圖4 乙酸乙酯和正丁醇部位對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of ethyl acetate and n?butanol moieties on xanthine oxidase

4 討論

黃嘌呤氧化酶為一種分布于臟器和血管的鉬羥化酶，是能催化次黃嘌呤與黃嘌呤使之產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶［10?11］。當嘌呤代謝紊亂時，尿酸易積聚在各臟腑和關(guān)節(jié)中，引發(fā)高尿酸或痛風疾病。治療手段多采用黃嘌呤氧化酶抑制劑來降低黃嘌呤氧化酶活性，進而減輕尿酸引起的危害。黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選［12?13］主要通過紫外分光光度法來檢測酶促反應速率及相關(guān)酶動力學常數(shù)，但在以中藥作為檢測對象時，因其所含化合物眾多，在紫外光下多具有較強的吸收，易超出儀器的檢測靈敏范圍，同時由于其專屬性差，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。可通過高效液相色譜法來分離樣品成分、黃嘌呤底物和尿酸產(chǎn)物，從而建立其專屬性檢測［9］。本實驗采用建立紫外與高效液相結(jié)合的方法，通過HPLC 的專屬性來篩選出活性部位，并采用UV 法來探究其對黃嘌呤氧化酶的相關(guān)酶促反應動力學指數(shù)。利用該方法，初步證明桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位對黃嘌呤氧化酶具有較強的抑制活性，并且該抑制類型為可逆性抑制。同時，除桑樹外，桑寄生亦可在多種植物上生長［14?16］，因此本研究考察了幾種常見植物［17］上的桑寄生對黃嘌呤氧化酶活性的抑制水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除楓樹、桃樹、黃皮樹和大葉冬青這4 種植物外，其余植物上的桑寄生藥材IC50均大于100 μg／mL，少數(shù)植物達到200 μg／mL 以上，證明了桑寄生對黃嘌呤氧化酶抑制活性受到寄主植物的影響，且以桑樹為寄主的抑制作用最強。

表3 不同寄主的桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.3 Inhibition rates of different extraction sites from different hosts of Taxilli Herba（，n＝3）

表3 不同寄主的桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.3 Inhibition rates of different extraction sites from different hosts of Taxilli Herba（，n＝3）