電子眼、電子鼻和電子舌鑒別不同品種、不同產(chǎn)地生地黃

李建軍 常筱沛 馬靜瀟 賀敬穎 董世可楊梅

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng)453007； 2.天津埃文森科技有限公司， 天津300384）

地黃為玄參科地黃屬Rehmannia glutinosaLibosch.的多年生草本植物［1］，主產(chǎn)于河南、山西等地，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。地黃以河南道地產(chǎn)區(qū)“古懷慶府”產(chǎn)者最佳，所產(chǎn)地黃稱懷地黃，屬“四大懷藥”之一。地黃藥材根據(jù)炮制方法的不同分為鮮地黃、生地黃和熟地黃。鮮地黃秋季采挖，呈紡錘形或條形；生地黃為地黃緩緩烘培至八成干所得，多為不規(guī)則團(tuán)塊狀；熟地黃為地黃加工炮制而成，多為不規(guī)則塊片［1?2］。

目前，對(duì)生地黃的真?zhèn)蝺?yōu)劣評(píng)價(jià)往往以傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別為主，主觀性較強(qiáng)，描述模糊，缺乏客觀的量化指標(biāo)。現(xiàn)在多種現(xiàn)代化技術(shù)分析手段在地黃的鑒別研究中得到應(yīng)用，如HPLC 多成分測(cè)定法、DNA 條形碼技術(shù)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等［3?7］。這些方法雖能對(duì)地黃進(jìn)行準(zhǔn)確分析鑒別，但普遍存在耗時(shí)長(zhǎng)、預(yù)處理復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。故采用電子眼、電子鼻、電子舌技術(shù)，運(yùn)用主成分分析方法對(duì)地黃顏色、氣味、滋味進(jìn)行區(qū)分鑒別，擬建立更為客觀準(zhǔn)確，能快速識(shí)別的方法，為地黃藥材的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)及其產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展提供新思路。

1 材料

在懷區(qū)收集目前種植和流通量最大的9 種地黃主栽品種，編號(hào)1～9，于2019 年4 月種植在溫縣農(nóng)科所地黃資源圃中，常規(guī)田間管理；不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”地黃分別種植在河南、山西、陜西、甘肅，編號(hào)10～13，詳見表1。均于2019 年12 月采收，經(jīng)河南師范大學(xué)李發(fā)啟教授鑒定為玄參科地黃屬地黃Rehmannia glutinosaLibosch.。將所得鮮地黃參照文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道的生地黃加工技術(shù)方法，置于58 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，烘焙置完全透心，發(fā)汗12 h，制備成生地黃。

表1 生地黃來(lái)源Tab.1 Sources of raw R.glutinosa

IRIS VA400 電子眼系統(tǒng)（法國(guó)Alpha MOS 公司）；Heracles NEO 電子鼻系統(tǒng)（法國(guó)Alpha MOS公司）；ASTREE Ⅱ電子舌系統(tǒng)（法國(guó)Alpha MOS公司）；電子天平（瑞士Meteler?Toledo 公司）；ZRD?A5110 鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；低溫磨粉機(jī)（德國(guó)海蒂詩(shī)公司）。

正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（nC6～Nc16）（法國(guó)Alpha MOS 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；0.1 mol／L HCl 溶液（法國(guó)Alpha MOS 公司）。

2 方法

2.1 生地黃電子眼分析 電子眼是以仿生學(xué)為基礎(chǔ)的一種能對(duì)復(fù)雜非均質(zhì)樣品視覺信息進(jìn)行分析、識(shí)別的檢測(cè)儀器，模擬人眼對(duì)樣品的感知，主要應(yīng)用于飲料、食品的色彩分布等研究［9］。將生地黃樣品放置白板紙上，每個(gè)品種包含3 個(gè)批次，電子眼開機(jī)后穩(wěn)定15 min 使光源無(wú)偏差，待燈綠開始使用。校正鏡頭曝光度和焦距等數(shù)值，使用24 色色彩校正板進(jìn)行校正，光圈采用5 mm，光源使用D65，打開頂部光源以消除背景。校正后拍照，每個(gè)樣品選取至少5 個(gè)不同部位進(jìn)行成像分析處理。

2.2 生地黃電子鼻分析 電子鼻是一種能客觀全面對(duì)復(fù)雜氣味進(jìn)行快速定性和定量分析的電子系統(tǒng)，可模擬人的嗅覺，通過(guò)信號(hào)處理系統(tǒng)對(duì)樣品的氣味進(jìn)行分析，主要應(yīng)用于煙酒、茶葉、化工、食品、環(huán)境等檢測(cè)［10?12］。將生地黃樣品用組織搗碎機(jī)進(jìn)行打粉，過(guò)5 號(hào)篩，稱量1.0 g 地黃粉末置于20 mL 的電子鼻專用頂空瓶中，使用PTFE 隔墊嚴(yán)密隔絕氣味，待分析樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器上［13?14］。校準(zhǔn)液為正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（nC6～Nc16）。

2.3 生地黃電子舌分析 電子舌是一種能識(shí)別、分析樣品滋味成分的檢測(cè)儀器，能判別出樣品之間味覺的差異，主要應(yīng)用于茶葉、調(diào)味品、酒水等食品味道的評(píng)價(jià)［13?16］。本研究分析采用第6 套傳感器 系統(tǒng)，包 括 AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS 共7 根傳感器。選擇Ag／AgCl 作為參比電極，通過(guò)軟件對(duì)信號(hào)值的分析，能夠在0 到12的刻度上比較不同樣品間的各種滋味的相對(duì)強(qiáng)度。將生地黃樣品粉碎，過(guò)5 號(hào)篩，稱取2 g 粉末于燒杯中，加入50 mL 60 ℃蒸餾水，超聲處理30 min，靜置1 h，濾紙過(guò)濾后取25 mL 置于電子舌專用燒杯中待測(cè)，重復(fù)3次，每檢測(cè)1 個(gè)樣品后對(duì)傳感器進(jìn)行1 次徹底清洗。樣品采集時(shí)間為120 s，每次分析時(shí)間為180 s。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Alpha soft 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用主成分分析（PAC）法，通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)向量進(jìn)行線性變換，對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 生地黃電子眼分析結(jié)果

3.1.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃鑒別 對(duì)懷區(qū)9種樣品進(jìn)行電子眼的PCA 分析，由圖1 可知，第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）之和達(dá)到了86.722%，代表了樣品絕大部分信息，其識(shí)別指數(shù)為99，識(shí)別指數(shù)框?yàn)榫G色，說(shuō)明各個(gè)樣品之間在顏色上存在差異。在主成分分析圖中，樣品間的相對(duì)距離越近，則樣品整體顏色越接近。“金九”與“85?5”樣品間的相對(duì)距離最近，顏色最相近；“噸王”和“懷豐”分別分布在單獨(dú)的區(qū)域且與其他品種相對(duì)距離較遠(yuǎn)，顏色差別較大。各樣品整體顏色差異較大，使用電子眼能迅速區(qū)分懷區(qū)不同主栽品種生地黃。

圖1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃電子眼主成分分析圖Fig.1 Principal component analysis diagrams of electronic eye for different main plants of R.glutinosa in Henan

3.1.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃鑒別 對(duì)不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”樣品進(jìn)行電子眼的PCA 分析，由圖2 可知，PC1 與PC2 之和達(dá)到了98.966%，其識(shí)別指數(shù)為100。河南溫縣與山西、陜西、甘肅所產(chǎn)“北京3 號(hào)”樣品間相對(duì)距離均較遠(yuǎn)，各樣品整體顏色差異較大。其中河南溫縣與山西所產(chǎn)“北京3 號(hào)”分別分布在PCA 圖中不同區(qū)域；陜西與甘肅所產(chǎn)“北京3 號(hào)”分布在相同區(qū)域，相對(duì)距離較近。同一品種不同產(chǎn)區(qū)生地黃的顏色差異與土壤壞境條件有關(guān)，土壤環(huán)境條件越近差異越小，土壤環(huán)境條件越遠(yuǎn)差異越大。

圖2 不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”生地黃電子眼主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis diagrams of electronic eye for R.glutinosa of ＂ Beijing No.3＂ from different habitats

3.2 生地黃電子鼻分析結(jié)果

3.2.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃鑒別 由圖3 可知，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了91.644%，其識(shí)別指數(shù)達(dá)到96，說(shuō)明基于氣味上的差異能有效區(qū)分這9 種懷地黃樣品。在主成分分析圖中，樣品間的相對(duì)距離越近，則樣品整體氣味越接近，“師大地黃1 號(hào)”與“師大地黃2 號(hào)”樣品的相對(duì)距離最近，氣味差別較小；懷地黃主栽品種“懷豐”分布在左側(cè)區(qū)域，其它樣品分布在右側(cè)區(qū)域，且各品種間存在一定相對(duì)距離，說(shuō)明“懷豐”氣味與其它樣品差異較大。

圖3 懷區(qū)不同主栽品種生地黃電子鼻主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis diagrams of electronic nose for different main plants of R.glutinosa in Henan

3.2.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃鑒別 由圖4 可知，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了95.057%，其識(shí)別指數(shù)達(dá)到99，說(shuō)明基于氣味上的差異能有效區(qū)分不同產(chǎn)地地黃樣品。河南溫縣與甘肅所產(chǎn)“北京3 號(hào)”各單獨(dú)分布在一個(gè)區(qū)域，與其他產(chǎn)區(qū)氣味差別較大；山西與陜西所產(chǎn)“北京3 號(hào)”氣味差別較小，這是由于各產(chǎn)區(qū)不同氣候環(huán)境條件的差異造成的。利用AroChemBases 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的差異較大的色譜峰進(jìn)行定性可知，生地黃氣味差異可能由于乙醛、乙醇、2，3?丁烷、乙腈、己醛等揮發(fā)性氣體含量差異引起，說(shuō)明使用電子鼻能迅速區(qū)分同一品種不同產(chǎn)地生地黃，揮發(fā)性成分的差異可作為判別生地黃質(zhì)量?jī)?yōu)劣的參考依據(jù)之一。

圖4 不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”生地黃電子鼻主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis diagrams of electronic nose for R.glutinosa of ＂ Beijing No.3＂ from different habitats

3.3 生地黃電子舌分析結(jié)果

3.3.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃鑒別 懷區(qū)9 種不同主栽品種懷地黃RSD 分別為0.42%、1.35%、0.56%、0.34%、0.42%、0.22%、0.22%，樣品3次重復(fù)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都比較小，說(shuō)明樣品在重復(fù)測(cè)試過(guò)程中電子舌儀器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。由圖5 可知，PC1 與 PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了95.060%，其識(shí)別指數(shù)為93，說(shuō)明這9 種生地黃樣品滋味能夠快速地通過(guò)電子舌很好區(qū)分開來(lái)。在主成分分析圖中，樣品間的相對(duì)距離越近，則樣品整體滋味越接近，其中“金九”與“85?5”樣品的相對(duì)距離最近，滋味差別最小；“噸王”與“沁懷”的相對(duì)距離最遠(yuǎn)，滋味差別最大。

圖5 懷區(qū)不同主栽品種生地黃電子舌主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis diagrams of electronic tongue for different main plants of R.glutinosa in Henan

從圖6 中能更直觀地看出樣品間在滋味上有差別，不同主栽品種懷地黃在不同傳感器上信號(hào)反應(yīng)強(qiáng)度存在差異，其中“噸王”在酸味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)，“師大地黃1 號(hào)”在咸味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)，“懷豐”在鮮味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)。

圖6 懷區(qū)不同主栽品種生地黃滋味雷達(dá)圖Fig.6 Radar chart for the taste of different main plants of R.glutinosa in Henan

3.3.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃鑒別 不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”生地黃樣品RSD 分別為0.20%、0.79%、0.39%、0.28%、0.20%、0.17%、0.15%，說(shuō)明樣品在重復(fù)測(cè)試過(guò)程中電子舌儀器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。由圖7 可知，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了99.221%，其識(shí)別指數(shù)為94，說(shuō)明不同產(chǎn)地地黃樣品滋味能夠快速地通過(guò)電子舌很好區(qū)分開來(lái)，其中同一生地黃品種“北京3 號(hào)”山西與甘肅所產(chǎn)樣品滋味差別最大，且各產(chǎn)地“北京3號(hào)”生地黃間存在一定距離。

圖7 不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”生地黃電子舌主成分分析圖Fig.7 Principal component analysis diagrams of electronic tongue for R.glutinosa of “Beijing No.3”from different habitats

從圖8 中能更直觀地看出樣品間在滋味上有差別，其中河南溫縣產(chǎn)“北京3 號(hào)”生地黃在酸味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)，山西產(chǎn)“北京3 號(hào)”生地黃在咸味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)，陜西產(chǎn)“北京3 號(hào)”生地黃在鮮味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)，甘肅產(chǎn)“北京3 號(hào)”生地黃在咸味傳感器上相對(duì)強(qiáng)度較強(qiáng)。

圖8 不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”生地黃滋味雷達(dá)圖Fig.8 Radar chart for the taste of R.glutinosa of“Beijing No.3”from different habitats

3.4 擬合分析

3.4.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃 將懷區(qū)9 種不同主栽品種樣品的電子眼、電子鼻和電子舌數(shù)據(jù)整合在一起，數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見圖9，其中PC1 與PC2 之和達(dá)到了65.588%，其區(qū)分指數(shù)為94，說(shuō)明各個(gè)樣品之間在顏色、氣味和滋味整體上存在差異。樣品間距離越遠(yuǎn)，整體感官差別越大，其中“懷豐”“噸王”“沁懷”分別分布在圖中不同區(qū)域，相對(duì)距離較遠(yuǎn)，與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的“懷豐”“噸王”“沁懷”遺傳背景、形態(tài)特征、指標(biāo)成分含量差異較大相符合；“北京3 號(hào)”“85?5”“金九”“星科”“師大地黃1號(hào)”“師大地黃2 號(hào)”相對(duì)距離較近，與“北京3號(hào)”“85?5”“金九”“星科”“師大地黃1 號(hào)”“師大地黃2 號(hào)”遺傳背景相近相符合。

圖9 懷區(qū)不同主栽品種生地黃擬合主成分分析圖Fig.9 Principal component analysis diagram for different main plants of R.glutinosa in Henan

3.4.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃 圖10 中PC1與PC2 之和達(dá)到了67.67%，其區(qū)分指數(shù)為91，說(shuō)明各個(gè)樣品之間在顏色、氣味和滋味整體上存在差異。河南溫縣、山西、陜西、甘肅所產(chǎn)“北京3號(hào)”分別分布在主成分分析圖的4 個(gè)區(qū)域，且相對(duì)距離較遠(yuǎn)，差異明顯，不同產(chǎn)區(qū)的生態(tài)因子造成不同產(chǎn)區(qū)生地黃整體感觀差異。

圖10 不同產(chǎn)地“北京3 號(hào)”生地黃擬合主成分分析圖Fig.10 Principal component analysis diagram for R.glutinosa of “ Beijing No.3 ” from different habitats

4 討論

當(dāng)前地黃藥材市場(chǎng)存在因地黃品種更新?lián)Q代過(guò)快，品種之間品質(zhì)參差不齊，品種混雜退化嚴(yán)重，非道地產(chǎn)區(qū)地黃藥材充斥市場(chǎng)，藥材鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系缺乏快捷精準(zhǔn)檢測(cè)方法和手段。而中藥的顏色、氣味、滋味是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣、鑒別真?zhèn)渭捌洚a(chǎn)地的重要依據(jù)［17?18］。本研究采用電子眼、電子鼻和電子舌技術(shù)首次對(duì)不同品種、不同產(chǎn)地的生地黃在顏色、氣味、滋味上測(cè)定分析和比較。電子眼、電子鼻、電子舌均可以有效地將道地產(chǎn)區(qū)不同主栽品種生地黃或同一品種不同產(chǎn)地生地黃迅速區(qū)分開來(lái)；生地黃的顏色差異與遺傳背景和土壤環(huán)境條件有關(guān)；氣味成分的差異和滋味（酸味、咸味、鮮味）的綜合評(píng)判可以作為地黃藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣評(píng)價(jià)的參考依據(jù)。電子眼、電子鼻、電子舌的擬合應(yīng)用可以有效地將道地產(chǎn)區(qū)不同主栽品種生地黃或同一品種不同產(chǎn)地生地黃迅速區(qū)分開來(lái)，生地黃顏色、氣味、滋味可作為地黃藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的參考依據(jù)。

電子眼、電子鼻、電子舌技術(shù)對(duì)藥材的鑒別研究在通關(guān)藤真?zhèn)危?1］、南北五味子區(qū)分［13］等中應(yīng)用。該技術(shù)在藥材上的應(yīng)用提高了判別樣品的可操作性，能使樣品分析速度更快捷、精準(zhǔn)，具有樣品無(wú)需過(guò)多加工處理，過(guò)程無(wú)污染，數(shù)據(jù)分析結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。電子眼、電子鼻及電子舌技術(shù)已趨于成熟，是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的新嘗試，能準(zhǔn)確判別藥材的顏色、氣味和滋味，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。