干蟾中蟾毒配基類成分含量動態變化規律

葛珈銘鄧莎趙盈 遲凱文 李佳榮 李夢園 李先寬

（天津中醫藥大學， 天津301617）

干蟾為兩棲綱蟾蜍屬動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Bufo MelanostictusSchneider 除去內臟的干燥體，首載于 《本經逢原》［1］，性味辛涼，有毒，具有消腫解毒、利尿之功效，其水溶液制劑具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等作用［2?4］，臨床上用于治療帶狀皰疹、肺癌、肝癌、胃癌、惡性腫瘤等疾病［5?9］。目前，隨著市場需求不斷增加，蟾蜍在許多省份均有養殖，但并未形成規范統一的質量標準［10?11］，導致市場上干蟾皮質量參差不齊。本研究以刮漿后的干蟾為研究對象，對不同生長年限干蟾中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈4 種指標成分進行測定，旨在對不同生長年限的干蟾進行質量評價，并探究干蟾成分累積與生長年限等因素的關系，為干蟾的規范化生產，蟾蜍類藥材資源高效利用提供依據。

1 材料

LC?20AT 型 HPLC 儀（日本島津公司）；KH3200B 型數控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器公司）；FA2004 萬分之一電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；Sartorius BT125D 十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE?52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KDM 型調溫電熱套（北京永興精佳儀器有限公司）。

蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111981?201501、110718?201108、110803?201406）；蟾毒它靈對照品（天津萬象恒遠科技有限公司，批號20180115）。乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；磷酸二氫鉀（分析純，批號20141218）；磷酸（分析純）；重蒸餾水。

4 批干蟾均購自吉林市昌邑區某蟾蜍養殖合作社，加工方式均為蟾蜍刮漿，腹部切開，剝取皮，保留頭、足、骨骼，玻璃板上及時展開晾干，經天津中醫藥大學張堅副教授鑒定為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 的干燥全體，見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相乙腈（A）?0.5%磷酸二氫鉀（B），磷酸調節pH 為3.2，梯度洗脫（0～15 min，30%～61% B；15～30 min，61% B；30～32 min，30% B）；檢測波長296 nm；體積流量0.7 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，分別制成蟾毒它靈0.051 3 mg／mL、蟾毒靈0.053 8 mg／mL、華蟾酥毒基0.085 0 mg／mL、脂蟾毒配基0.050 0 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取干蟾皮藥材粉末（過3 號篩），精密稱定2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濃縮回收甲醇，用甲醇定容到5 mL，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrogram of various constituents

2.3 線性關系考察 精密吸取蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品，分別進樣測定，記錄峰面積，以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，繪制標準曲線，見表2。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度試驗 精密吸取4 種對照品溶液各20 μL，進樣測定6次，測得蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品峰面積RSD 分別為0.53%、0.74%、0.81%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 0～12 h 內每間隔2 h 分別進樣1次，測得蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為1.64 %、1.47 %、0.68%、1.09 %，表明樣品在12 h 內穩定性良好。

2.6 重復性試驗 平行制備6 份樣品，進樣測定，測得蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積RSD 分別為1.59%、2.35%、1.54%、1.68%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 樣品分成3 組（高、中、低質量濃度），每組2份，每份1 g，精密加入4 種對照品貯備液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，吸取20 μL 進樣測定，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.8 含量測定 稱取一定量4 種不同年限的干蟾，精密稱定，分3 次進樣，測定藥材中各成分含量，見表4、圖2。

圖2 蟾毒配基類成分含量百分比Fig.2 Percentage contents of bufogenin constituents

表4 各成分含量測定結果（mg／g）Tab.4 Results of content determination for various constituents（mg／g）

3 討論

通過對干蟾的性狀進行分析總結，干蟾隨年份增長顏色加深、質量增大、耳后腺及皮脂腺數目增多且逐漸充盈。HPLC 法測定華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈4 種指標成分含量，10年生與3 年生相比，分別下降70.1%、63.5%、64.1%、75.1%。干蟾中4 種蟾毒配基類成分含量呈逐年下降趨勢，為3 年生＞5 年生＞8 年生＞10年生。

歷代本草所述蟾蜍越大，痱磊越多，藥效更強。這與本實驗結果相悖，是由于干蟾中的化學成分隨年份增長積累至痱磊中且古時蟾蜍用法多為活蟾剝取皮，不刮去痱磊中分泌物，而本研究對象為刮漿后的干蟾，結合劉美等［12］研究發現，蟾酥中的化學成分含量高于干蟾中化學成分含量，因此呈現成分含量隨年限增長而逐年下降趨勢。歷代本草中記載蟾蜍皮主要用于治療惡瘡，其主要物質基礎是蟾蜍毒素類成分［13］，而本研究測定的指標成分為蟾毒配基類成分，其細胞毒性較小，主要為強心作用［14］。

市場上干蟾炮制加工方式主要有2種，一種是刮漿后去除內臟、骨骼、肌肉纖維，另一種是刮漿后僅去除內臟。歷代本草中記載［15?16］均以蟾蜍皮入藥，現今市場為提高藥材產量常見第二種炮制方式，依據本研究結果及羅毅［17］、周謐［11］等研究分析，保留骨骼、肌肉纖維會造成各成分比例變化，減緩干燥速率，導致微生物繁殖，造成干蟾菌檢不合格，影響干蟾的臨床療效。

3 年生干蟾中蟾毒配基類成分含量最高，但為使蟾蜍類藥材經濟效益最大化，應綜合考慮蟾蜍其他藥用資源（干蟾、蟾衣、蟾酥）的效益，蟾酥中的蟾毒配基類成分含量遠高于干蟾及蟾衣，且隨年份增長，干蟾質量增大，因此干蟾應在蟾蜍生長8～10 年取盡蟾酥后采收為宜。