紅芪多糖對脂多糖誘導小鼠膿毒癥心肌病的保護作用

張 玲孫媛 高春華 隋海娟 于海英 楊育紅?

（1.錦州醫科大學基礎醫學院， 遼寧 錦州121001； 2.錦州醫科大學附屬第一醫院， 遼寧 錦州121001；3.錦州醫科大學藥學院， 遼寧 錦州121001； 4.錦州醫科大學基礎醫學實驗教學中心， 遼寧 錦州121001）

膿毒癥是一種由感染導致的宿主反應失調，可引起危及生命的器官功能障礙的全身炎癥反應綜合征［1］，約50%膿毒癥患者會出現不同程度的心肌損傷。膿毒癥心肌病作為膿毒癥的常見并發癥，可使患者死亡率達80%左右［2?3］。積極探索膿毒癥心肌病的有效治療方案是醫學界關注的重點。紅芪多糖作為紅芪的主要活性成分，是從紅芪干燥根中提取的多糖。現代藥理學研究發現，紅芪多糖具有抗炎、免疫調節、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗腫瘤等作用［4?6］，具有保護糖尿病心肌病小鼠和急性心肌梗死大鼠心肌損傷的作用［7?8］，但對膿毒癥心肌病是否存在影響未見報道。本研究運用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立小鼠膿毒癥心肌病模型，探討紅芪多糖對模型小鼠心肌損傷的保護作用及對TLR4 信號通路的影響，以期為膿毒癥心肌病的治療提供理論參考。

1 材料

1.1 動物 50 只雄性C57BL／6N 小鼠，體質量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2021?0006。所有小鼠飼養于錦州醫科大學SPF 級實驗動物中心，溫度（21±1）℃，相對濕度（55±5）%，實驗動物使用許可證號SYXK（遼）2019?0007。所有實驗操作均符合錦州醫科大學動物倫理委員會要求（審查號2020041）。

1.2 試劑與藥物 紅芪多糖（純度90%），甘肅益生祥生物技術有限公司，用時以生理鹽水稀釋。LPS，美國Sigma 公司；ELISA 試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；TLR4 一抗，美國Santa Cruz 公司；IκBα、NF?κB 一抗，美國Cell Signaling公司；β?actin，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器 ACUSON 彩色多普勒超聲診斷儀，德國Siemens 公司；iMark 酶標檢測儀、電泳儀，美國Bio?Rad公司；BX51 型熒光顯微鏡，日 本Olympus 公司；ChampGel 3000 型凝膠成像系統，北京賽智創業科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及造模 參照文獻［9］ 報道方法建立膿毒癥心肌病模型，50 只小鼠適應性飼養1 周后，按隨機數字表法分為空白組、LPS 組及紅芪多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），每組10 只。紅芪多糖組灌胃相應劑量紅芪多糖，空白組和LPS 組灌胃等量蒸餾水，連續給藥14 d后，LPS 組和紅芪多糖組均一次性腹腔注射10 mg／kg LPS 建立膿毒癥心肌病小鼠模型，空白組則腹腔注射蒸餾水。

2.2 小鼠心功能檢測 小鼠腹腔注射LPS 8 h后，用七氟醚對其進行麻醉，超聲診斷儀檢測左心室射血分數（LVEF）、左心室縮短分數（LVFS）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）等指標。

2.3 ELISA 法檢測血清炎癥因子水平 小鼠心功能檢測完畢后，心臟取血，4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，取上層血清，分裝后于－20 ℃冰箱保存備用。按ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細胞介素?1β（IL?1β）和白細胞介素?6（IL?6）水平。

2.4 小鼠心肌組織HE 染色 小鼠取血后，按0.5 mL／100 g 腹腔注射20% 烏拉坦麻醉，開胸取出心臟，剪去心臟周圍多余的組織，在生理鹽水中洗凈并用濾紙吸干水分，一部分于－80 ℃冰箱保存，用于RT?qPCR 和Western blot 檢測；另一部分于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，浸蠟，包埋，制備4 μm石蠟切片，進行常規HE 染色，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，蘇木精染色，鹽酸分化，伊紅染色，乙醇脫水透明，樹脂封片，200 倍顯微鏡下觀察心肌組織形態。

2.5 RT?qPCR 法檢測心肌組織中TLR4、IκBα、NF?κBmRNA 表達 剪取各組小鼠心肌組織，經過裂解、抽提、RNA 沉淀和清洗，提取心肌總RNA，用第一鏈cDNA 合成試劑盒逆轉錄成單鏈cDNA（哈爾濱新海基因檢測有限公司）。從GenBank 中查詢小鼠TLR4、IκBα和NF?κB的基因序列，應用Primer 5.0 引物設計軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行RT?qPCR反應，所得數據采用2－ΔΔCT法計算小鼠心肌組織中TLR4、IκBα、NF?κBmRNA 相對表達。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測TLR4、IκBα、NF?κB 蛋白表達 取60 mg 凍存的心肌組織，加入胞漿蛋白抽提試劑充分勻漿，按總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。制膠，SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉液封閉后，加入稀釋的TLR4、IκBα、磷酸化IκBα（p?IκBα）、NF?κB、磷酸化NF?κB（p?NF?κB）和β?actin 一抗，4 ℃雜交孵育過夜，次日洗膜后加二抗25 ℃孵育1 h，ECL 法顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值，以β?actin 為內參，計算目的蛋白相對表達。

2.7 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析和LSD 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 紅芪多糖對小鼠心功能的影響 由表2 可知，與空白組比較，LPS 組小鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD 降低了44.09%、60.86%、29.67%、40.47%（P＜0.01），說明造模成功，小鼠心功能受損；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心功能指標均升高（P＜0.05，P＜0.01），并與藥物劑量呈正相關。

表2 各組小鼠心功能比較（，n＝5）Tab.2 Comparison of mouse cardiac functions of each group（，n＝5）

表2 各組小鼠心功能比較（，n＝5）Tab.2 Comparison of mouse cardiac functions of each group（，n＝5）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與LPS 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 紅芪多糖對小鼠心肌形態的影響 如圖1 所示，空白組小鼠心肌的形態及排列無異常，未見炎性細胞浸潤，組織間隙無異常變化；與空白組比較，LPS 組小鼠心肌細胞呈現異常變形，心肌組織間有炎性細胞浸潤，部分心肌細胞有空泡狀改變；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心肌細胞的形態隨藥物劑量增加而逐漸趨向正常，細胞空泡和炎性細胞浸潤情況減輕，說明紅芪多糖可改善膿毒癥心肌病的病理變化。

圖1 各組小鼠的心肌組織形態（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology of mouse myocardium of each group（HE，×200）

3.3 紅芪多糖對小鼠血清炎癥因子水平的影響如圖2 所示，與空白組比較，LPS 組小鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?6 水平均升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?6 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性。

圖2 各組小鼠血清TNF?α、IL?1、IL?6 水平比較（，n＝5）Fig.2 Comparison of mouse serum TNF?α，IL?1 and IL?6 levels of each group（，n＝5）

3.4 紅芪多糖對小鼠心肌組織TLR4、IκBα、NF?κBmRNA 表達的影響 如圖3 所示，與空白組比較，LPS 組小鼠心肌組織TLR4、NF?κBmRNA 表達升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心肌組織TLR4、NF?κBmRNA 表達均降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性；各組小鼠心肌組織中IκBαmRNA 表達無明顯差 異（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠心肌組織TLR4、 IκBα、 NF?κB mRNA 表達比較（，n＝3）Fig.3 Comparison of TLR4，IκBα and NF?κB mRNA expressions in mouse myocardial tissue of each group（，n＝3）

3.5 紅芪多糖對小鼠心肌組織TLR4／IκBα／NF?κB 信號通路相關蛋白表達的影響 如圖4 所示，與空白組比較，LPS 組小鼠心肌組織TLR4、p?IκBα／IκBα、p?NF?κB／NF?κB 蛋白表達升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，紅芪多糖各劑量組小鼠心肌組織TLR4、p?IκBα／IκBα 和p?NF?κB／NF?κB 蛋白表達均降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

圖4 各組小鼠心肌組織TLR4、IκBα、NF?κB 蛋白表達比較（，n＝3）Fig.4 Comparison of TLR4，IκBα and NF?κB protein expressions in mouse myocardial tissue of each group（，n＝3）

4 討論

中醫認為膿毒癥的病機主要為正氣不足、毒熱內蘊、絡脈癖滯，氣血失運，臟腑失于濡養。心臟便是受累的臟腑之一。雖然很多研究探尋膿毒癥心肌病的發病機制［10?12］，但目前該病仍以支持治療為主，尚缺乏針對性治療藥物。紅芪系豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys的干燥根，2020 年版《中國藥典》記載紅芪的功能有“補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌”［13］。紅芪多糖作為紅芪的主要活性成分，可通過補氣、益氣使得血脈行、痰濁化、經絡濡養［7］。由上述中醫理論推測，紅芪多糖對膿毒癥心肌病可能存在保護作用。

臨床研究顯示，膿毒癥心肌病的典型表現是心功能障礙［14］，且心臟結構會發生病理性改變［15］。借鑒張勝等［16］的評定標準，可通過檢測心功能和觀察心肌組織形態學改變評價該病模型是否成功。本實驗發現，LPS 組小鼠各項心功能指標均較空白組下降，組織切片可見心肌細胞受損和炎性細胞浸潤，由此可判定膿毒癥心肌病模型制備成功。紅芪多糖干預后，膿毒癥小鼠心功能指標有顯著改善，心肌細胞受損程度和炎癥細胞浸潤情況減輕，提示紅芪多糖對LPS 誘導小鼠的膿毒癥心肌病具有保護作用。

有研究表明TLR4 信號通路是引起膿毒癥的主要通路［17］。TLR4 是Toll 樣受體家族中重要的成員之一，表達于心肌細胞、免疫細胞和上皮細胞等表面，能識別LPS 和器官損傷后釋放的內源性配體［18］。TLR4 被LPS 激活后可使IκBα 磷酸化，作為NF?κB 蛋白的主要抑制劑，IκBα 缺乏或活性改變可導致NF?κB 活性失調，介導發生各種感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤等［19］。發生磷酸化的IκBα 降解，進而使NF?κB 活化，啟動炎性細胞因子轉錄，釋放TNF?α、IL?1β、IL?6 等促炎因子，引起一系列膿毒癥的病理結果，包括血管外滲、組織損傷、多臟器功能衰竭甚至死亡［20］。本實驗結果顯示，經紅芪多糖干預后，LPS 誘導的小鼠血清炎癥因子水平降低，心肌組織中TLR4、NF?κB mRNA和蛋白表達降低，p?IκBα／IκBα 比值降低。以上結果表明，紅芪多糖可通過調控TLR4／IκBα／NF?κB 信號通路抑制促炎因子TNF?α、IL?1β 和IL?6 的釋放，改善小鼠心功能，抑制心肌組織的病理改變。

綜上所述，本研究證實紅芪多糖對LPS 誘導小鼠的膿毒癥心肌病具有保護作用，其機制可能與調控TLR4／IκBα／NF?κB 信號通路有關。