基于TLR4／MyD88／NF?κB 信號通路探討龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮行為的影響

趙建軍 彭曉明 李婷婷 朱鑫磊 王偉龍 漆哲寧劉立?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 甘肅 蘭州730000）

焦慮癥是最常見的精神障礙，核心特征包括過度恐懼和焦慮，恐懼是由迫在眉睫的威脅產(chǎn)生，而焦慮是對未來威脅的一種預(yù)期狀態(tài)［1］。流行病學(xué)顯示，我國焦慮癥的12 個月患病率為5.0%，終生患病率為7.6%［2］。目前，抗抑郁藥物選擇性5?羥色胺（5?HT）再攝取抑制劑（SSRIs）是治療焦慮癥的一線用藥，但其常伴有頭痛、失眠、性功能下降等不良反應(yīng)［3］。因此，從多角度闡明焦慮癥的病理機制，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點和尋找更有效的抗焦慮方法無疑是值得探索的方向。

近年來，應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在焦慮癥病理過程中的作用逐漸受到專家學(xué)者的關(guān)注。其中，Toll樣受體4（TLR4）在應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中扮演極其重要的角色［4］，其可通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子?κB（NF?κB），刺激促炎細胞因子的釋放。研究表明，通過調(diào)節(jié)TLR4／NF?κB 信號通路，可逆轉(zhuǎn)束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠焦慮行為［5?6］。龍牡安神顆粒是臨床經(jīng)驗處方，具有安神定驚、養(yǎng)心健脾功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，龍牡安神顆粒在臨床上治療焦慮癥療效確切，但其具體作用機制尚不明確［7］。因此，本實驗采用慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型，通過觀察龍牡安神顆粒對焦慮模型小鼠行為學(xué)及TLR4／MyD88／NF?κB 信號通路的影響，探討其發(fā)揮抗焦慮作用的可能機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性昆明小鼠，8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號62001000000621，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020?0001。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22 ± 2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h／12 h 明暗交替的SPF 環(huán)境中，實驗動物使用許可證號 SYXK（甘）2020?0009，所有實驗均在09：00至15：00 之間進行。

1.2 試劑與藥物 龍牡安神顆粒（龍骨30 g、牡蠣30 g、磁石30 g、珍珠母30 g、遠志9 g、酸棗仁15 g、合歡皮10 g、首烏藤10 g、甘草10 g、浮小麥30 g、大棗6 g、茯苓12 g、太子參10 g、桂枝6 g、生姜6 g、石菖蒲6 g）為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒，批號分別為1060433、1052093、1080083、0123753、1105103、1033643、1055633、1035763、1080933、1012623、1081343、1050723、1030843、1045483、1020733、1052113。鹽酸帕羅西汀片（樂友，浙江華海藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031106，20 mg／片，批號0000012020）。BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20210814）；TNF?α、IL?1β、IL?6 ELISA 試劑盒（江蘇麥莎實業(yè)有限公司，批 號 202201、202201、202201）；TLR4抗體、MyD88 抗體、NF?κB 抗體、p?NF?κB 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號 BA08313887、AH10163311、BA07072298、BA09108701）；GAPDH抗體（英國Abcam 公司，批號GR303514?13）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號210060240）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號HB170809）。

1.3 儀器 iMark 酶標(biāo)儀（美國Bio?Rad 公司）；5424R 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；DNP?9022 型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo 公司）；DYCZ?25D 型Western blot 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；DM2500 型顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 48 只雄性昆明小鼠隨機選取8 只作為空白組，其余40 只作為造模組。空白組不束縛，造模組小鼠參考文獻［5，8］ 報道，采用慢性束縛應(yīng)激法復(fù)制焦慮小鼠模型，將小鼠放入改造過的50 mL 離心管中（管壁有供動物呼吸的氣孔），每日束縛2 h，持續(xù)35 d，束縛時間在09：00～15：00 時間段內(nèi)隨機安排。造模第14 天行高架十字迷宮實驗，與空白組比較，若慢性束縛應(yīng)激造模組小鼠進入開臂次數(shù)、開臂停留時間減少，則說明造模成功。

2.2 分組及給藥 造模成功的小鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組、鹽酸帕羅西汀組（陽性藥）和龍牡安神顆粒高、中、低劑量組，每組8 只。按照成人和動物體表面積折算，鹽酸帕羅西汀灌胃劑量為2.6 mg／kg，龍牡安神顆粒 高、中、低劑量為4.16、2.08、1.04 g／kg（臨床等效劑量的2、1、0.5 倍）。從第15 天開始，每天束縛結(jié)束后0.5 h，給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物（10 mL／kg），空白組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)21 d。末次給藥后，各組小鼠進行行為學(xué)檢測（高架十字迷宮、曠場實驗），行為學(xué)實驗結(jié)束后，斷頭取全腦，冰上迅速分離海馬。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮距離地面50 cm，由2 個開臂（30 cm×5 cm×0.6 cm）和2個閉臂（30 cm×5 cm×15 cm）經(jīng)中央平臺（5 cm×5 cm）垂直交叉組成。測試時，將小鼠置于中央平臺，頭朝開臂，記錄5 min 內(nèi)小鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)及在各臂停留的時間。每次實驗后用75%乙醇擦拭迷宮，再將下一只小鼠放入。

2.3.2 曠場實驗 曠場箱（30 cm×30 cm）分為周圍和中央兩個區(qū)域，中央?yún)^(qū)大小為15 cm×15 cm的小正方形。測試時，將小鼠置于曠場箱的中央，記錄5 min 內(nèi)小鼠進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)及停留時間。每次實驗后用75%乙醇溶液徹底清潔曠場箱，再進行下一只小鼠的實驗。

2.3.3 ELISA 法檢測海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平 制備10%小鼠海馬組織勻漿，離心后取上清液，采用ELISA 試劑盒檢測上清液中炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6 水平，操作過程遵循試劑盒說明書進行。

2.3.4 RT?qPCR 法檢測海馬組織TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達 按照RNA 提取試劑盒說明書提取小鼠海馬組織總RNA，然后根據(jù)HifairⅢ1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real?time PCR 儀進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計算TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.3.5 Western blot 法檢測海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達 冰上提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗TLR4、MyD88、NF?κB、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜后加入二抗（1∶6 000），顯影后使用Image Pro Plus 圖像處理軟件分析蛋白相對表達量。

2.3.6 免疫組化法檢測海馬組織p?NF?κB 蛋白表達 組織切片經(jīng)脫蠟處理后，檸檬酸鈉修復(fù)2次，3%過氧化氫孵育15 min，PBS 沖洗3次，用p?NF?κB 抗體（1 ︰ 100）4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染1 min，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照，使用Image Pro Plus 圖像處理軟件分析p?NF?κB 蛋白表達。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，符合正態(tài)性及方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用LSD 法；方差不齊則用Dunnett’s T3 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠高架十字迷宮實驗的影響 與空白組比較，模型組小鼠進入開臂次數(shù)、開臂停留時間和進入開臂次數(shù)百分比均減少（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠進入開臂次數(shù)、開臂停留時間和進入開臂次數(shù)百分比均增加（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠高架十字迷宮實驗的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the elevated plus maze test（，n＝8）

表2 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠高架十字迷宮實驗的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the elevated plus maze test（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.2 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠曠場實驗的影響 與空白組比較，模型組小鼠進入中央?yún)^(qū)域次數(shù)及停留時間減少（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠進入中央?yún)^(qū)域次數(shù)及停留時間均增加（P＜0.01），見表3。

表3 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠曠場實驗的影響（，n＝8）Tab.3 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the open field test（，n＝8）

表3 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠曠場實驗的影響（，n＝8）Tab.3 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the open field test（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.3 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平降低（P＜0.01），龍牡安神顆粒低劑量組小鼠海馬組織IL?6 水平降低（P＜0.01），見表4。

表4 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平的影響（ng／L，，n＝8）Tab.4 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus TNF?α，IL?1β and IL?6 levels of mice exposed to chronic restraint stress（ng／L，，n＝8）

表4 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平的影響（ng／L，，n＝8）Tab.4 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus TNF?α，IL?1β and IL?6 levels of mice exposed to chronic restraint stress（ng／L，，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.4 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見表5。

表5 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、 MyD88、 NF?κB mRNA 表達的影響（，n＝8）Tab.5 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus mRNA expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

表5 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、 MyD88、 NF?κB mRNA 表達的影響（，n＝8）Tab.5 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus mRNA expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.5 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒各劑量組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見表6、圖1。

圖1 各組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白條帶圖Fig.1 TLR4，MyD88 and NF?κB protein bands in mouse hippocampus of each group

表6 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達的影響（，n＝8）Tab.6 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus protein expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

表6 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達的影響（，n＝8）Tab.6 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus protein expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.6 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2、表7。

表7 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達的影響（，n＝8）Tab.7 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus expression of p?NF?κB protein of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

表7 龍牡安神顆粒對慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達的影響（，n＝8）Tab.7 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus expression of p?NF?κB protein of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

圖2 各組小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白免疫組化染色圖（×400）Fig.2 Immunohistochemistry of p?NF?κB protein in mouse hippocampus of each group（×400）

4 討論

焦慮癥是一種常見的與各種應(yīng)激源相關(guān)的神經(jīng)精神疾病，急性和慢性應(yīng)激暴露均可誘發(fā)焦慮癥［9］。慢性束縛應(yīng)激是誘導(dǎo)嚙齒動物出現(xiàn)焦慮樣行為的可靠方法，能夠模擬慢性壓力對人類病理生理的影響，在抗焦慮藥物的研究中被廣泛使用。高架十字迷宮實驗和曠場實驗是評價抗焦慮藥物效果的經(jīng)典方法。本實驗發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，慢性束縛應(yīng)激造模14 d后，小鼠進入開臂次數(shù)、開臂停留時間均減少，說明慢性束縛應(yīng)激焦慮模型復(fù)制成功；與模型組比較，使用龍牡安神顆粒干預(yù)21 d后，小鼠進入開臂次數(shù)、開臂停留時間、進入曠場中央?yún)^(qū)域次數(shù)和中央?yún)^(qū)域停留時間均增加，提示龍牡安神顆粒具有改善慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮行為的作用。

應(yīng)激反應(yīng)可激活中樞及外周免疫系統(tǒng)，共同促進神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)社會挫敗應(yīng)激可激活先天免疫系統(tǒng)，招募外周促炎單核細胞進入中樞，增加中樞及外周循環(huán)中促炎細胞因子的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生［10?12］。此外，外周循環(huán)中的促炎細胞因子也可以利用迷走神經(jīng)和特定的細胞因子轉(zhuǎn)運體等多種途徑通過血腦屏障，進一步加強中樞神經(jīng)炎癥信號［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，腹膜注射TNF?α 和IL?6 抑制劑可改善大鼠的焦慮樣行為和認知功能［14］；海馬區(qū)IL?1β 基因敲除可減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及焦慮行為［15］。現(xiàn)代藥理研究表明，遠志、酸棗仁、甘草、小麥、大棗均具有降低中樞促炎細胞因子水平，保護神經(jīng)元細胞的作用［16?18］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平升高；龍牡安神顆粒干預(yù)后，小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6水平降低。以上結(jié)果提示，龍牡安神顆粒改善慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮行為可能與減少海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平有關(guān)。

TLR4 是激活先天免疫系統(tǒng)的重要受體，在神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生和小膠質(zhì)細胞活化中發(fā)揮重要作用［19］。NF?κB 通常以P65 和P50 形成的異二聚體存在于細胞質(zhì)中，靜息狀態(tài)下無活性，MyD88 是TLR4 向下轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF?κB 的關(guān)鍵銜接蛋白，TLR4可通過MyD88 依賴途徑激活下游NF?κB，活化后NF?κB 被轉(zhuǎn)運進細胞核，參與促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄與釋放［4，20］。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，持續(xù)的慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)可使模型組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF?κB mRNA及蛋白表達升高，說明慢性束縛應(yīng)激激活了TLR4／MyD88／NF?κB 信號通路，通過龍牡安神顆粒干預(yù)后，小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF?κB mRNA 及蛋白表達均有不同程度降低，提示龍牡安神顆粒發(fā)揮抗焦慮作用的機制可能與抑制TRL4／MyD88／NF?κB 信號通路，減少炎性介質(zhì)的釋放和表達有關(guān)。

綜上所述，龍牡安神顆粒能改善慢性束縛應(yīng)激小鼠的焦慮行為，其機制可能與抑制TRL4／MyD88／NF?κB 信號通路，減少促炎介質(zhì)的釋放和表達有關(guān)。