USP10與肺發(fā)育及相關(guān)疾病

林中源，張金三

1.溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科/浙江省介入肺臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325000；3.浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 溫州 325035

0 引言

泛素化是一種廣泛存在并且嚴(yán)格調(diào)控的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modifications,PTMs），是控制細(xì)胞內(nèi)底物蛋白最終命運(yùn)的最重要機(jī)制。泛素化過程包括三個(gè)關(guān)鍵步驟以及三類關(guān)鍵蛋白的參與，包括泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）[1]。首先，E1通過消耗ATP來激活泛素（ubiquitin，Ub）；其次，E1將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移至E2；最后，E2同時(shí)攜帶E3以及激活形式的泛素識別靶蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行泛素化修飾過程[2]。因?yàn)榈孜锏鞍椎奶禺愋允怯蒃3決定的，所以E3在整個(gè)泛素化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。此外，識別、降解、亞細(xì)胞定位以及組裝成底物蛋白的功能復(fù)合物都是由泛素鏈決定的。泛素化還分為單泛素化和多泛素化兩種，單泛素化即一個(gè)Ub分子連接到靶蛋白一個(gè)或幾個(gè)的賴氨酸殘基上，一般發(fā)生在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和囊泡分類等途徑；然而，多泛素化即Ub分子鏈連接到靶蛋白的賴氨酸殘基上，這種過程主要發(fā)生在蛋白質(zhì)降解中。

去泛素化（DUBs）本質(zhì)上為水解反應(yīng)的去泛素化過程，DUBs將泛素分子從目標(biāo)蛋白底物上分割下來，進(jìn)而調(diào)控泛素連接酶的活性。泛素化-去泛素化途徑共同調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括蛋白質(zhì)降解（蛋白酶體和溶酶體）、凋亡、細(xì)胞存活、細(xì)胞周期進(jìn)程、染色體分離以及基因表達(dá)等[4]。DUBs屬于蛋白酶超家族，其中按催化機(jī)制分為五類：天冬氨酸、金屬、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸蛋白酶[5]。DUBs大多數(shù)為半胱氨酸蛋白酶，他們與Ub進(jìn)行共價(jià)結(jié)合；少數(shù)為金屬蛋白酶，可以與Ub形成非共價(jià)鍵[6]。按照催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分類還可以將他們分為以下七個(gè)家族：泛素特異性蛋白酶家族（USPs)、泛素C末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、卵巢腫瘤蛋白酶家族（ovarian tumorrelated proteases，OTUs）、Machado-Josephin蛋白酶家族（Machado-Josephin disease protein domain proteases，MJDs）、Jab 1/MPN域相關(guān)金屬異肽酶（Jab1/MPN domain associated metalloisopeptidase，JAMMs）和單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白家族（monocyte chemotactic proteininduced protein，MCPIP）[7]，以及最近發(fā)現(xiàn)的鋅指含泛素肽酶1(zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUP1)[8]。在人類基因組中編碼DUBs約100種，其中USPs含有超過50種[9]，這原因在于E3的數(shù)量在進(jìn)化過程中增加，USP的數(shù)量也隨之增加，這表明兩者之間的密切關(guān)系導(dǎo)致了它們的共同進(jìn)化[10]。USP10作為USP蛋白酶家族中的一員，其被報(bào)道特異性識別的底物已經(jīng)超過20種，在人類的多種疾病中發(fā)揮重要作用。我們總結(jié)了USP10底物的相關(guān)信號通路來預(yù)測USP10在肺發(fā)育過程以及在肺疾病中的潛在影響。

1 USP10的結(jié)構(gòu)特征

人源USP10基因位于染色體16q24.1，包含19個(gè)外顯子，其mRNA編碼的蛋白含有798個(gè)氨基酸，在進(jìn)化過程中高度保守。USP10的亞細(xì)胞定位廣泛，幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞的胞核及胞漿中（NCBI Gene:9100）。我們將氨基酸序列在PTMcode數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)USP10有51個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)，包括47個(gè)磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)泛素化位點(diǎn)（圖1A）。在DNA損傷時(shí)，ATM磷酸化USP10的Thr42及Ser337位點(diǎn)，使得部分USP10入核并與P53相互作用調(diào)節(jié)其泛素化水平[11]。此外，我們通過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)USP10含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是ataxin-2c和泛素特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域（USP）（圖1B）。

（圖1A）USP10的51個(gè)潛在的翻譯后修飾位點(diǎn)，每個(gè)矩形代表一個(gè)氨基酸，其中藍(lán)色矩形為磷酸化位點(diǎn)，綠色矩形為泛素化位點(diǎn)，紅色矩形為被ATM磷酸化的位點(diǎn)。（圖1B）USP10含有一個(gè)ataxin-2 C-terminal域，一個(gè)USP域，一個(gè)P53結(jié)合位點(diǎn)以及兩個(gè)PPXY基序。

2 USP10與肺發(fā)育

依據(jù)關(guān)鍵的形態(tài)轉(zhuǎn)變肺發(fā)育過程可分為五個(gè)階段：胚胎期、假腺期、小管期、終末囊泡期和肺泡期。在這期間肺經(jīng)歷了肺芽發(fā)生、細(xì)胞命運(yùn)確定、分支形態(tài)發(fā)生、囊泡發(fā)育以及肺泡發(fā)育[12]。這一過程涉及細(xì)胞分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及多條相關(guān)信號通路的參與如音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）[13]，Hippo[14]，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)[15]，成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）[16-17]等。這些信號通路如何穩(wěn)定行使功能還有待進(jìn)一步挖掘。近幾年的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)USP10除了調(diào)控包括P53[11],NF-B[18]，SIRT6[19]等蛋白穩(wěn)定性外，還有部分底物直接影響上述參與肺臟發(fā)育信號通路并有可能對肺臟發(fā)育存在直接影響。

2.1 USP10與Hippo通路

Hippo信號通路除參與了細(xì)胞命運(yùn)決定、干細(xì)胞調(diào)節(jié)、再生、免疫、腫瘤發(fā)生之外，還在發(fā)育過程中參與調(diào)節(jié)器官大小[14]。Yes相關(guān)蛋白（Yes associated protein,YAP）與帶有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）是Hippo通路中一對關(guān)鍵的下游效應(yīng)因子[20]。TAZ KO小鼠會(huì)導(dǎo)致肺泡呈肺氣腫樣間隔變大、肺泡腔簡化的發(fā)育異常，這非常類似于COPD的病癥表現(xiàn)[21]。Morin-Kensicki等研究顯示YAP KO會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎死亡[22]；最近的報(bào)道也發(fā)現(xiàn)特異性敲除Shh譜系中YAP會(huì)導(dǎo)致器官形態(tài)發(fā)生異常[21]。因此，YAP/TAZ及其調(diào)節(jié)因子被認(rèn)為是肺發(fā)育異常的重要因素。YAP/TAZ的蛋白水平及功能主要通過磷酸化和泛素化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控。大腫瘤抑制激酶（large tumor suppressor homologue 1/2，Lats1/2）誘導(dǎo)YAP Ser381處發(fā)生磷酸化，抑制YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性，隨后招募E3泛素連接酶SCFβ-TRCP和泛素介導(dǎo)YAP降解[23]。USP10能夠抑制SCFβ-TRCP和泛素參與的YAP/TAZ降解過程，逆轉(zhuǎn)YAP/TAZ的泛素化水平，從而調(diào)控YAP/TAZ豐度[24]。近期Danielle R.Little團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在肺臟發(fā)育過程中，YAP/TAZ的缺失會(huì)影響NKX2.1與肺泡一型細(xì)胞（alveolar type 1，AT1）譜系特異性位點(diǎn)結(jié)合，從而影響AT1、AT2譜系的分化。這意味著USP10很有可能通過調(diào)節(jié)YAP/TAZ的穩(wěn)定性，對肺泡上皮譜系的正常發(fā)育有重要意義，表明USP10對肺發(fā)育異常可能具有潛在的保護(hù)作用[25]。YAP從結(jié)構(gòu)上主要分為兩種剪切異構(gòu)體，只含有一個(gè)WW結(jié)構(gòu)域的一型YAP以及含有兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域的二型YAP，且與YAP互作的蛋白均含有PPXY基序[26]，我們在NCBI中尋找USP10的序列時(shí)發(fā)現(xiàn)USP10也含有兩個(gè)PPXY基序（圖 1B）。目前這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的存在是否和USP10與YAP的互作有關(guān)還不得而知。這表明USP10對YAP活性調(diào)節(jié)能力可能與YAP本身的亞型有關(guān)，并且預(yù)示著USP10與肺臟發(fā)育也存在著密切關(guān)系。

2.2 USP10與自噬

自噬的溶酶體降解途徑在細(xì)胞，組織，機(jī)體穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著重要作用[27]。參與自噬通路中多種重要蛋白的水平與多種人類疾病相關(guān)如：炎癥疾病，癌癥以及神經(jīng)退行性疾病等。USP10在近些年中也發(fā)現(xiàn)了幾種影響自噬通路的特異性底物如：Beclin1、P62、LC3B等。USP10與USP13可通過影響B(tài)eclin1的泛素化水平影響B(tài)eclin1的穩(wěn)定，進(jìn)一步影響B(tài)eclin1參與的Vsp34復(fù)合體的功能。Beclin1亦可以轉(zhuǎn)而影響USP10以及USP13的去泛素化活性從而影響P53蛋白水平[28]。但，USP10在肺發(fā)育假腺期的其他潛在功能目前還沒有被探索和重視。肺發(fā)育過程中存在兩個(gè)自噬高峰期：①E12.5；②E16.5～E18.5[29]。妊娠早期（E10.5）和妊娠晚期（E16.5）條件性敲除肺上皮細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)會(huì)分別導(dǎo)致分支形成和球囊形成的減少、遠(yuǎn)端上皮分化延遲等表型[29]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），作為自噬過程中細(xì)胞能量感知以及參與細(xì)胞信號調(diào)控的重要激酶之一，在能量應(yīng)激過程中人類肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）參與的AMPK磷酸化過程會(huì)因其自身的泛素化水平而受到抑制。去泛素化酶USP10可以特異性去除AMPK的泛素化，并促進(jìn)LKB1磷酸化AMPK過程。能量應(yīng)急時(shí)，磷酸化AMPK會(huì)磷酸化UPS10的Ser76，這使USP10對AMPK的磷酸化活性增強(qiáng)。USP10-AMPK正反饋環(huán)促進(jìn)了細(xì)胞能量波動(dòng)的調(diào)節(jié)作用[30]。因此，探究USP10在肺臟發(fā)育過程中對自噬的影響有望為臨床上因自噬異常引起的肺發(fā)育異常設(shè)計(jì)靶向藥物提供新思路。

3 USP10與肺癌

肺癌是全世界范圍內(nèi)最常見的癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[31]。肺癌主要分為兩種類別，即非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）包括肺腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌與小細(xì)胞肺癌。目前肺癌是以手術(shù)切除、化療為主要的治療方法。由于其復(fù)發(fā)率高并且對于許多化療藥物具有耐藥性[32]，因此，進(jìn)一步了解肺癌發(fā)病機(jī)制，尋找肺癌致病靶點(diǎn)，開發(fā)新的肺癌靶向藥物迫在眉睫。近幾年關(guān)于USP10的報(bào)道中表明，USP10在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用。

3.1 USP10-P53與肺癌的潛在關(guān)系

P53作為腫瘤抑制因子中重要的成員之一，可參與調(diào)控?cái)?shù)百種基因，這些基因又參與了多種生物學(xué)活動(dòng)，包括DNA損傷，細(xì)胞周期阻滯，衰老以及凋亡。在正常情況下，USP7（HAUSP）在細(xì)胞核中可直接去泛素化P53或間接的通過影響鼠雙微體基因2（murine double minute 2，MDM2）來調(diào)節(jié)P53蛋白的泛素化水平。核外的P53會(huì)由USP10直接去泛素化來穩(wěn)定P53。在致癌信號刺激時(shí)，部分USP10由ATM磷酸化Thr42與Ser337后入核發(fā)揮功能穩(wěn)定P53[11]。有趣的是，USP10并不能像USP7那樣通過影響MDM2調(diào)控P53水平。最新研究發(fā)現(xiàn)，在致癌信號刺激條件下USP10可以通過去泛素化和穩(wěn)定p14ARF，隨后p14ARF通過與MDM2的互作來調(diào)節(jié)P53的水平[33]。并且在作者發(fā)現(xiàn)的C-myc/p14ARF/P53通路中，C-myc可以通過與USP10的第二個(gè)啟動(dòng)子的結(jié)合，調(diào)控USP10的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控p14ARF與下游P53水平。但在非小細(xì)胞肺癌中C-myc上調(diào)、USP10成正常水平、p14ARF下調(diào)。因此，C-myc/USP10/p14ARF通路在非小細(xì)胞肺癌中的重要作用，預(yù)示著治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)。此外，在肺癌中USP10還可以通過直接與PTEN的相互作用來發(fā)揮腫瘤的抑制作用[34]。最新的研究表明，真核翻譯起始因子γ1（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1，EIF4G1）在NSCLC細(xì)胞系中高表達(dá)，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)作者還發(fā)現(xiàn)其與USP10有直接相互作用，并且USP10作為EIF4G1的負(fù)調(diào)控因子可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[35]。上述研究提示USP10/EIF4G1/P53相關(guān)機(jī)制的重要性，這可能是NSCLC類癌癥的新型治療靶點(diǎn)。與USP10互作的另一種底物—胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白3（Insulinlike growth factor 2 mRNA-binding protein 3，IGF2BP3）也與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[36]。IGF2BP3 mRNA與蛋白水平主要在肺鱗癌與肺腺癌中呈高水平趨勢，并且IGF2BP3的C端KH域可與USP10相互作用，通過降低USP10對P53蛋白的去泛素化活性，使P53蛋白水平和半衰期持續(xù)下降，促進(jìn)腫瘤在肺部的發(fā)生、增殖和侵襲。因此，針對IGF2BP3/USP10/P53通路進(jìn)行靶向藥物的開發(fā)很有可能是肺癌的另一種治療途徑。

3.2 USP10-HDAC6與肺癌的潛在關(guān)系

HDAC6屬于IIb級HDAC家族[37]，可參與多種蛋白的去乙酰化，包括Hsp90[38]，MSH2[39]等。HDAC6脫乙酰酶活性的失調(diào)和HDAC6的過度表達(dá)都與癌癥發(fā)生和順鉑耐藥有關(guān)[40-41]。并且在有P53突變的NSCLC中USP10高表達(dá)，這些研究結(jié)果表明針對USP10抑制劑的開發(fā)或許能夠找到USP10-HDAC6-順鉑耐藥性軸的突破口。除具有去乙酰化活性，HDAC6對于MSH2蛋白表現(xiàn)出E3活性，通過降低MSH2的蛋白水平使增敏正常細(xì)胞對DNA損傷。但是有趣的是，USP10不但能去泛素化穩(wěn)定MSH2[42]，還可以直接去泛素和穩(wěn)定組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）[43]。因此，USP10去泛素化穩(wěn)定HDAC6以及MSH2的貢獻(xiàn)程度似乎影響了肺癌發(fā)生。雖然HDAC6在NSCLC中的作用已經(jīng)得到初步結(jié)論，但是HDAC6/USP10/MSH2的平衡關(guān)系在NSCLC中的作用還有待進(jìn)一步探索。總之，USP10底物的多樣性，導(dǎo)致其在肺癌中的作用錯(cuò)綜復(fù)雜，相關(guān)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 USP10與肺纖維化

肺纖維化是一種慢性、不可逆和致命的間質(zhì)性肺疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。肺部疾病及肺纖維化的發(fā)病率隨著人口老齡化而增加。最常見的肺纖維化類型是IPF，其中位生存期只有2～4年[44-45]。迄今，肺纖維化的發(fā)病機(jī)制仍不明確，并且沒有有效的治療藥物。因此，闡明肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效的治療藥物非常重要。目前公認(rèn)的肺纖維化發(fā)生發(fā)展歸因于成纖維細(xì)胞病灶的形成，如肺上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和周期性成纖維細(xì)胞的募集，最終導(dǎo)致膠原蛋白的大量沉積，從而影響肺組織正常結(jié)構(gòu)與功能[46]。USP10的下游底物分析表明，USP10在肺纖維化相關(guān)疾病中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4.1 去泛素化功能與肺纖維化

瘢痕和纖維化疾病的表征之一為整合素β1與β5在細(xì)胞膜表面豐度累計(jì)，從而導(dǎo)致TGFβ通路的進(jìn)一步激活，及纖維化標(biāo)志物，如α-sma等的表達(dá)。雖然還沒有USP10直接影響肺纖維化的報(bào)道，但最新的研究發(fā)現(xiàn)整合素β1是USP10的底物蛋白[47]，并且在過去的研究中發(fā)現(xiàn)整合素β1于上皮位置的特異性缺失會(huì)嚴(yán)重影響假腺期肺上皮的初級分支[48]。提示USP10在肺纖維化以及肺發(fā)育中的潛在作用。此外USP10還與肺癌和肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的EMT通路密切相關(guān)。例如EMT進(jìn)程中Snail2，Smad4，Slug的蛋白穩(wěn)定性均與USP10豐度成正相關(guān)，即USP10可以通過去泛素化作用抑制上述蛋白的蛋白酶體降解途徑[49-50]，預(yù)示USP10的過表達(dá)或敲低在肺癌、肺纖維化以及肺發(fā)育中會(huì)促進(jìn)或抑制EMT演進(jìn)過程。

4.2 非去泛素化功能與肺纖維化

除了USP 域可能參與肺纖維化進(jìn)程外，USP10去泛素化蛋白域也與CF有潛在聯(lián)系。在各種應(yīng)激情況下，如氧化應(yīng)激，會(huì)產(chǎn)生高細(xì)胞毒性的泛素化蛋白，泛素化蛋白增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性，并且隨著年齡的增加這種泛素化蛋白的累積量會(huì)因?yàn)榈鞍酌阁w途徑活性受損而逐漸增加。機(jī)體為減輕這種泛素化蛋白的大量累積所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，通過USP10與P62共同介導(dǎo)促進(jìn)泛素化蛋白向泛素化蛋白聚集體的轉(zhuǎn)變[51]。越來越多的證據(jù)顯示，泛素化蛋白聚集體的細(xì)胞毒性較泛素化蛋白低，這也是退行性疾病的產(chǎn)生的主要原因之一，如肺囊性纖維化（CPF）。囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）-△F508是在CPF中最典型的易聚集蛋白。USP10的N端和C端均能與泛素受體P62蛋白結(jié)合促進(jìn)（CFTR）-△F508泛素化聚集體形成來降低蛋白質(zhì)低聚物的數(shù)量以降低細(xì)胞毒性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。有趣的是，雖然C端參與了互作以及后續(xù)的調(diào)控過程，這種調(diào)控并不是通過去泛素化功能來實(shí)現(xiàn)的[52]。以上研究表明USP10除了通過底物去泛素化發(fā)揮作用，尚有非泛素化依賴的機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘。

5 結(jié)論與展望

近年的研究不斷地刷新我們對USP10功能和機(jī)制的認(rèn)知。本文重點(diǎn)總結(jié)，并進(jìn)一步推測USP10在肺臟發(fā)育、腫瘤以及肺纖維化過程中的作用及相關(guān)機(jī)制。迄今，盡管大部分USP10的研究局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，但已有應(yīng)用USP10敲除鼠在肝臟和心臟相關(guān)研究報(bào)道[53-54]。相關(guān)模型也將有助于闡明USP10在肺發(fā)育的作用和相關(guān)機(jī)制，如初期支氣管形成，末期肺泡發(fā)生與成熟等。另外還可以將其結(jié)合COPD、IPF和腫瘤模型探究USP10在肺部炎癥、纖維化及癌癥中的作用及機(jī)制。雖然USP10在肺臟發(fā)育及疾病的分子機(jī)制尚不清晰，但隨著USP10研究的不斷深入，更多功能以及相關(guān)機(jī)制將會(huì)逐漸被闡明。以USP10為靶點(diǎn)將有望為肺發(fā)育疾病及成年肺疾病挖掘新的治療策略，為臨床攻克肺臟疾病提供新思路。