裝載siRNA的納米陽離子脂質體在小鼠體內的藥代動力學研究

問天嬌，陳欣然，白 靖，鄭 穎，王雅鵑，于佩佩，崔京霞

(1．河北醫科大學第四醫院藥學部，河北 石家莊 050011；2．石藥集團中奇制藥技術有限公司，河北 石家莊 050035；3．河北醫科大學藥學院，河北省創新藥物研究與安全性評價重點實驗室，河北 石家莊 050017)

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一類長約20～25個核苷酸的雙鏈RNA分子，進入細胞后可誘發同源mRNA的特異性降解，導致目標基因沉默[1]。近年來RNA干擾(RNA interference，RNAi)藥物在疾病治療領域具有較好的開發潛力[2]。2018年世界上首款siRNA藥物Patisiran(商品名為Onpattro，Alnylam公司)，將siRNA靶向至甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)，特異性沉默TTR的mRNA并阻斷蛋白生成，獲批準用于臨床治療，這是RNAi技術發展史上的重大里程碑事件之一[3-4]。

雖然多項研究成果顯示出了RNAi藥物在腫瘤、基因疾病等治療上的應用前景，如Liu等[5]研究表明，siRNA能有效抑制P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白7的表達，顯著提升耐紫杉醇細胞對藥物的敏感性，有效逆轉非小細胞肺癌多藥耐藥性。但在體內實驗中，由于siRNA分子大、穩定性差、易被血液中的核酸酶降解、難穿透細胞膜等弊端，很難到達靶位點發揮療效，因此，如何增加藥物穩定性以及如何對體內微量的siRNA進行準確檢測和定量是siRNA藥物藥代動力學研究中的難題[6-7]。有研究報道了生物樣品中siRNA的定量方法，主要包括液質聯用法、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)檢測法、基于雜交的酶聯免疫法、液相色譜分析法和熒光分析法等[8-10]。基于SYBR GreenⅠ染料的qPCR，操作簡便、靈敏度高和重現性好[11]。本團隊在前期研究[12]已合成了目標siRNA序列，構建了表達質粒，并制備了該質粒的納米隱形陽離子脂質體。本文擬進行該siRNA脂質體的化學穩定性考察，并探索siRNA及其脂質體在小鼠體內的藥代動力學。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

NOD SCID小鼠12只，SPF級，雌性，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SYXK(京)2021-007，使用許可證號為SYXK(冀)2021-007。小鼠飼于屏障環境，溫度25～27℃，濕度60%左右，維持12 h光照及12 h黑夜循環，常規標準飼料喂養，飼料購自北京科澳協力飼料有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DNaseⅠ購自TaKaRa公司，80%血清購自Gibco公司，qPCR相關試劑(SYBR混合物、M-MLV逆轉錄酶、Oligo dT)購自Invitrogen公司，表達siRNA的陽離子脂質體和裸質粒(pDual-oligo)由石藥集團中奇制藥技術有限公司制備。DYY-11型電腦三恒多用電泳儀，購于北京六一儀器廠，qPCR儀購于日本BIOER公司。

1.3 siRNA脂質體酶切和血清中穩定性檢測

裸質粒和質粒脂質體采用課題組前期已構建的靶向腫瘤多藥耐藥1(multidrug resistance，MDR1)基因的siRNA表達質粒及裝載了該質粒的納米隱形陽離子脂質體[12]。

1.3.1 酶切穩定性檢測取裸質粒和質粒脂質體(以質粒計)2μg，平行各設5份，其中4份分別加入2 μL DNaseⅠ(50 U/μL)，在加入DNaseⅠ后20 min、1 h、4 h、24 h時提取DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，以未加入DNaseⅠ的裸質粒及脂質體為對照，通過ImageJ軟件對電泳條帶進行條帶灰度值測定，并計算各時間點DNA殘留率，以作用時間為橫坐標，siRNA質粒殘留率為縱坐標作圖。

1.3.2 血清中的穩定性檢測取裸質粒和質粒脂質體(以質粒計)2μg，平行5份，其中4份分別加入80%血清為實驗組，以未加入血清的脂質體及裸質粒為對照，按1.3.1中的方法進行后續瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 脂質體的藥代動力學檢測

利用qPCR方法建立siRNA質粒脂質體檢測曲線，設5個濃度梯度，依次為1 000、100、10、1、0.1μg/mL，PCR反應體系(SYBR混合物12.5μL，ddH2O 8.5μL，上、下游引物各1μL，模板2μL)，變性95℃、30 s，退火56℃、25 s，延伸72℃、30 s，循環40次完成PCR實驗，以siRNA脂質體濃度的常用對數(lgC)為橫坐標，CT值為縱坐標作圖，求得標準曲線。

將20μg siRNA裸質粒及siRNA質粒脂質體通過尾靜脈注射進入小鼠體內，分別在給予受劑物后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h、24 h取血，提取血液中總RNA，按照20μL逆轉錄反應體系(dNTP混合物1μL、0.1 mol/L的DTT 2 μL、50μmol/L的Oligo dT 1μL、5×RT反應緩沖液4μL、500 ng/μL的模板2μL、M-MLV逆轉錄酶1 μL、RNase out核酸酶抑制劑1μL、DEPC處理水8 μL)，在PCR儀上進行逆轉錄反應37℃、50 min，70℃、15 min，得到反應產物cDNA。以逆轉錄產物cDNA為模板，設空白對照(不加模板的反應系統)，進行PCR擴增，將所得的CT值代入上述標準曲線，計算各時間點的藥物濃度(以siRNA質粒計)，以時間為橫坐標，藥物濃度為縱坐標作圖，計算藥物的半衰期。

1.5 統計學方法

結果數據以±s表示，應用Origin 2019b統計軟件進行數據分析和圖像處理。采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA質粒脂質體化學穩定性的檢測結果

2.1.1 在DNaseⅠ中的穩定性結果顯示裸質粒在DNaseⅠ中僅20 min就全部降解；而質粒脂質體降解較緩慢，20 min、1 h、4 h的DNA殘留率依次為(45.78±4.57)%、(34.69±5.22)%、(22.88±3.98)%，直到24 h仍有(20.16±2.47)%的殘留，與裸質粒組相比，差異具有統計學意義(P＜0.01)，見圖1和圖2。上述結果說明質粒經脂質體包裹后得到有效的保護，siRNA在體內的穩定性是其發揮藥效的必要前提。

圖1 裸siRNA質粒和siRNA質粒脂質體在DNaseⅠ中的穩定性(瓊脂糖電泳)

圖2 裸siRNA質粒和siRNA質粒脂質體在DNaseⅠ中作用不同時間的DNA殘留率

2.1.2 在血清中的穩定性結果顯示裸質粒在80%血清中20 min時僅殘留(11.03±0.92)%，在1 h時基本全部降解；而質粒脂質體在20 min、1 h、4 h時DNA殘留率依次為(40.74±1.13)%、(26.61±0.98)%、(19.85±0.82)%，24 h時仍殘留(10.26±1.04)%，兩組間差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3和表1。說明質粒經脂質體包裹后得到有效的保護，可在血清中保持相對穩定。

圖3 裸siRNA質粒和siRNA質粒脂質體在80%血清中的穩定性(瓊脂糖電泳)

表1 裸siRNA質粒和siRNA質粒脂質體在80%血清中不同時間后的DNA殘留率/%

2.2 質粒脂質體在小鼠體內的定量檢測結果

qPCR對siRNA質粒脂質體藥代動力學檢測得到的曲線見圖4。標準曲線方程為y=-3.023x+22.014，R2=0.989，表明該脂質體在0.1～1 000μg/mL范圍內線性關系良好。在各時間點分別對小鼠體內裸siRNA質粒及siRNA質粒脂質體的濃度進行檢測，經過計算，脂質體包裹的質粒半衰期約為2 h，而裸質粒僅為6 min，見圖5。

圖4 小鼠體內siRNA脂質體藥代動力學檢測的標準曲線

圖5 siRNA質粒脂質體藥代動力學檢測

3 討論

近年來，研究者對RNAi藥物的研發熱情較高，一些研究成果也逐漸顯示出了RNAi藥物在基因疾病以及腫瘤等治療上的應用前景。但是RNAi的治療途徑尚不成熟，仍有一些障礙需要克服，包括其安全性、靶向性、遞藥系統、體內穩定性、定量研究等[13]。目前，為解決siRNA藥物在遞送時存在的穩定性問題，大多數研究均借助了載體[14]，使用最廣泛的非病毒載體包括脂質體、聚合物納米顆粒、肽、抗體和小分子等。脂質體是一種理想的藥物載體，具有良好的生物相容性、非免疫原性、易于功能化等優點，已用于包括腫瘤在內的多種疾病的臨床治療[15]。對于siRNA分子的裝載和運輸常使用陽離子脂質體[16-17]，陽離子脂質體攜帶的正電荷可以中和siRNA帶的負電荷，形成的復合物結構緊密，通過細胞膜的胞吞或融合作用進入細胞發揮作用，從而極大地延長循環時間，促進siRNA的遞送。

siRNA藥物的結構、性質等不同于化學藥物，其適用的檢測方法也不同。目前，已有多種方法用于生物基質中siRNA的絕對定量，對于體外化學合成修飾和體內載體表達的siRNA檢測，常使用qPCR方法[18]，將siRNA反轉錄成cDNA，對累積的擴增產物進行定量。qPCR敏感度高、重復性好且能夠特異檢測出生物樣品中的siRNA[19]，是應用于siRNA藥物體內藥代動力學評價較為理想的方法。

陽離子脂質體能夠保護核酸類藥物進入體內，是一種高效的遞送載體，它與siRNA帶的負電荷結合并將siRNA包封于內部，起到保護作用[20]。為了進一步確定陽離子脂質體作為核酸類藥物載體的可靠性，對于含微量siRNA的血液樣品，在提取siRNA和反轉錄過程中難免會造成siRNA的降解和損失。本文首先對siRNA脂質體在DNaseⅠ和血清中的穩定性進行了考察。結果提示，與裸質粒相比，siRNA表達質粒經過脂質體包封以后，在DNaseⅠ和血清中穩定性顯著增加。隨后的藥代動力學研究結果提示經脂質體包裹siRNA在小鼠體內半衰期明顯延長。

綜上所述，該脂質體能夠延長藥物的作用時間，提高藥物的生物利用度。隨著納米制劑新技術突飛猛進的發展，以脂質體為代表的納米藥物遞釋系統因其優越的理化性質和優異的生物相容性將受到更廣泛的關注。