人參培養須根的大鼠致畸試驗

劉 歡，梁 菲，李 瑩，吳莎莎，曹 璨，徐建文，劉 影，

(1．哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科，黑龍江 哈爾濱 150001；2．哈爾濱醫科大學食品藥品安全評價中心，黑龍江 哈爾濱 150001)

人參為五加科多年生草本植物人參(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，其主要成分包括人參皂苷、人參多糖及非皂苷成分等[1]。現代藥理學研究表明，人參具有改善記憶力、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤以及提高免疫力等功效[2-4]，因此人參在功能性食品和人體健康研究領域受到越來越多的關注[5]。國內外市場對人參的需求不斷增加，為了解決人參資源的短缺問題，人參組織培養物即人參培養須根(人參為不定根)生產培養技術被逐漸應用于人參及其生物活性成分的生產[6]。

人參培養須根可應用于食品、保健品、藥品和膳食補充劑等，并且在日本、韓國等已經實現了產業化[7]。近年來，我國也開始了人參培養須根的培養研究，但大部分集中在其培育及活性成分方面[8-9]，對其毒性研究鮮見報道。課題組之前的實驗對其急性毒性、遺傳毒性等進行了初步評價[10]，但未對其致畸性進行探究。因此，本文對人參培養須根進行致畸性檢測，為其安全開發利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 受試物

人參培養須根由東北林業大學生命科學院提供。人參培養須根由5年生園參須根誘導而來。培養平臺為1噸級植物生物反應器，接種量6 kg，培養基600 L，培養溫度24℃，培養時間65 d。樣品為人參培養須根烘干樣，外觀呈淡黃色粉末，總皂苷含量2.6%。該樣品推薦用量為每日2 g，成人體質量以60 kg計，則樣品用量相當于0.033 g/kg。

1.2 動物

SPF級性成熟SD大鼠(90～100 d)，雌性80只，雄性40只，均購自遼寧長生生物技術實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(遼)2010-0001；在SPF級動物實驗中心(屏障環境)飼養，使用許可證號SYXK(黑)2017-008，溫度為21～23℃，濕度為55%～58%。實驗動物所用的清潔級飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，生產許可證號SCXK(京)2009-0012。所有操作均符合哈爾濱醫科大學實驗倫理學要求(審批號HMUIRB20210004)。

1.3 主要試劑與儀器

甲醛和冰乙酸(北京現代東方精細化學品有限公司)，氫氧化鉀、水合氯醛和茜素紅(國藥集團化學試劑有限公司)，飽和苦味酸(上海信譽生物技術有限公司)，乙醇(天津市天力化學試劑有限公司)等。

CX21生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Motic SMZ168-BL型體視顯微鏡(麥克奧迪事業集團有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 劑量設置根據《食品安全國家標準 致畸試驗》中的劑量設置和前期研究基礎[10]，受試物劑量為2.0 g/kg(高劑量組)、4.0 g/kg(中劑量組)、8.0 g/kg(低劑量組)，分別相當于人體推薦劑量的60.5、121、242倍。由于受試物密度小，膨脹性高，最大可灌胃劑量為5.0 g/kg，而本實驗所需受試物濃度大，不適合灌胃，所以將樣品摻入飼料中。本課題組前期90天喂養實驗[10]將大鼠攝食量設置為體質量的8%，考慮到孕鼠的實際攝食量高于正常雌性大鼠，因此將攝食量以體質量的10%計算，則相當于飼料中添加樣品劑量分別為20.0、40.0、80.0 g/kg。用酪蛋白調節各組蛋白質與對照組相同，對照組給予基礎飼料。

1.4.2 試驗方法將雌雄以2∶1比例合籠。每日早晨檢查雌鼠陰栓，發現陰栓則認為該動物已交配，當日作為受孕“零天”，記作GD0。若5 d內某只雌鼠未交配，則更換雄鼠。將檢出的受孕大鼠按體質量隨機分到各組，每組16只，并編號、單籠飼養。在大鼠妊娠的6～15 d通過飼料連續給予受試物，對照組給予基礎飼料。動物自由攝食及飲水，在妊娠的第0、6、9、12、15、20天稱量孕鼠體質量，每日對動物進行一般行為觀察。在大鼠妊娠第20天斷頭處死，迅速剖腹取出子宮稱取子宮連胎質量和子宮質量，以得出妊娠動物的凈增質量，記錄總著床數、總黃體數、活胎數、早死胎數、晚死胎數及吸收胎數。處死時對所有動物進行肉眼觀察，保存肉眼發現有改變的臟器。逐一記錄胎仔性別、體質量、體長，檢查胎仔外觀有無異常。將存活胎鼠的1/2放入乙醇中固定3周，茜素紅染色，制作為胎鼠骨標本并進行檢查；另1/2胎鼠用Bouin's液固定2周，制作胎鼠內臟標本并進行檢查。

1.5 統計學處理

使用SPSS 19.0進行數據分析，孕鼠體質量、增質量、子宮質量、總著床數、總黃體數、吸收胎數、活胎數、死胎數、胎仔體質量、體長等計量資料用單因素方差分析，內臟畸形率、骨骼畸形率等計數資料采用χ2檢驗。對胎仔的相關指標統計以窩為單位。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 人參培養須根對孕鼠一般狀況及體質量的影響

實驗期間，各組大鼠一般狀況良好，被毛整潔，行動靈活，反應敏捷，進食飲水正常，生長發育良好，未見流產或早產等異常反應及體征。與對照組相比，各劑量組孕鼠體質量差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。表明人參培養須根對孕鼠的體質量無明顯影響。

表1 人參培養須根對孕鼠體質量和攝食量的影響(g，n=16)

2.2 人參培養須根對胚胎早期發育的影響

結果見表2。與對照組相比，人參培養須根各劑量組對胎鼠死亡率、胚胎吸收率、窩平均活胎數均無明顯影響(P＞0.05)。

表2 人參培養須根對大鼠胚胎早期發育的影響

2.3 人參培養須根對胎鼠生長影響

結果見表3。與對照組相比，人參培養須根各劑量組子宮質量、胎鼠體長、體質量的差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表3 人參培養須根對胎鼠生長的影響

2.4 人參培養須根對胎鼠骨骼發育的影響

結果見表4。與對照組相比，不同劑量的人參培養須根胎鼠的肋骨發育無明顯影響(P＞0.05)，胎鼠骨骼正常發育率均在98%以上。

表4 人參培養須根對胎鼠骨骼發育的影響

2.5 人參培養須根對胎鼠內臟發育的影響

結果見表5。與對照組相比，不同劑量的人參培養須根對胎鼠內臟發育無明顯影響(P＞0.05)。

表5 人參培養須根對胎鼠內臟發育的影響

3 討論

人參作為傳統名貴中藥材，不僅具有極高的藥用價值，近年來在保健品領域也受到越來越多的關注[11-12]。目前，人參野生資源稀少，而栽培人參由于栽培周期長、農藥和重金屬污染等各種各樣的問題無法完全滿足市場需求。利用細胞工程手段通過培養植物細胞、組織或器官獲取有效物質成為一種有效途徑。人參細胞和根系培養物生長快速，代謝產物穩定，已經廣泛作為人參田間栽培的替代品[13-14]。近年來，我國也開始了人參培養須根的培養研究，但大多集中在其培育及活性成分方面，人參培養須根研究中最主要的活性成分人參皂苷也被一些研究指出可能具有致畸毒性。Liu等[15]通過全胚胎培養發現，人參皂甙Rb1對大鼠、小鼠胚胎具有直接的致畸作用，主要表現在冠臀長度、頭長和體節數的減少。另外有研究提出，人參皂甙的致畸性具有濃度依賴性，越低的濃度可能會導致越嚴重的畸形，使得這種毒性更容易被忽略[16]。但也有研究認為，產生致畸作用的人參皂苷劑量遠遠超過人類正常攝入量，所以在女性懷孕期間正常服用人參并不會對自身及其胎兒產生不良影響[17]。因此，基于人群研究和動物實驗的這種矛盾結果，有必要對不同濃度的人參培養須根進行致畸性研究，為其安全應用提供科學依據。

本實驗按照GB 15193.14-2015《食品安全國家標準 致畸試驗》的要求進行了致畸試驗[18]。結果顯示，與對照組相比，在人參培養根須為2、4和8 g/kg劑量下，受孕大鼠的體質量未表現出明顯變化，胚胎總著床數、總黃體數、死胎數、活胎數、吸收胎數無顯著差異，同時對胎鼠外觀、骨骼、內臟無明顯致畸作用。表明在本研究條件下，人參培養須根無母體毒性、胚胎毒性和致畸性，未觀察到有害作用劑量。本課題組前期對人參培養根須進行了急性毒性和90天喂養實驗，均未發現其任何毒性作用，本研究證明了人參培養根須無致畸作用，完善了人參培養根須毒性作用評價證據，為人參培養須根的安全應用提供了一定的毒理學支持，為其將來進一步在藥品、食品、化妝品等下游領域的應用提供了基礎數據。