DNA依賴性蛋白激酶催化亞基在非同源末端連接修復中作用的研究進展

張天楓，趙樂天，廖明星，李仁燕

(國家衛生健康委出生缺陷與生殖健康重點實驗室，重慶市人口和計劃生育科學技術研究院，重慶 400020)

DNA是最重要的遺傳物質，在維持機體新陳代謝和平衡的生命活動中，DNA持續發生不同程度的損傷，其中雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)最為嚴重且普遍存在，每個細胞每天大約經歷10～100次DSB[1]。造成DSB的因素有外源性(電離輻射、化療藥物和機械損傷等)和內源性(氧化自由基、細胞代謝產物與復制叉崩塌等)。病理性DSB會導致細胞生長停滯、細胞死亡和染色質重排，后者易造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，導致腫瘤的發生發展[2]。當細胞發生DSB后，主要有兩條修復途徑，即同源重組(homologous recombination，HR)修復與非同源末端連接(nonhomologous DNA end joining，NHEJ)修復。HR修復依賴完全相同的同源染色體為模板進行精準修復，主要發生在細胞S和G2期[3]。NHEJ途徑則不需要修復模板，通過修復相關因子，直接連接損傷的DNA兩端，修復速度快，但容易產生錯誤(包括缺失、插入和點突變)，可在整個細胞周期發生，主要發生在G0/G1期[4]。當高能粒子或射線誘導DSB，則優先通過NHEJ途徑修復損傷的DNA[5-6]。

經典的NHEJ修復(classical NHEJ，C-NHEJ)過程包括由Ku70/80組成的異二聚體對DSB的識別，募集DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)至損傷的DNA末端，內切酶Artemis對DNA末端剪切，多聚酶填補空缺脫氧核苷酸，再由連接酶復合體X射線交叉互補蛋白4(X-ray cross-complementing protein 4，XRCC4)、XRCC4樣因子(XRCC4-like factor，XLF)和連接酶IV(ligase IV)，連接損傷的DSB兩端，修復成完整的DNA鏈[7]。由Ku70/80異二聚體與DNA-PKcs形成的DNA-PK復合體，在NHEJ修復過程中發揮關鍵作用。其中DNA-PKcs屬于磷脂酰肌醇3-激酶樣蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase-like protein kinase，PIKK)家族成員，其激酶活性在NHEJ修復過程中發揮至關重要的作用，當DNA-PKcs激酶失活，導致輻射敏感性和DSB修復缺失的增加，也可導致可變區(variable，V)、多樣區(diversity，D)、連接區(joining，J)重組與免疫缺失[8]。本文綜述了DNA-PKcs的蛋白結構特征，及其如何被募集到DSB位點，如何被激活發揮NHEJ修復作用，同時結合目前新的研究發現，總結DNA-PKcs自身構象的變化對其發揮生物學功能的影響，為進一步深入研究DNA-PKcs在DSB修復中的重要作用以及相關疾病的發生提供理論基礎。

1 DNA-PKcs的結構

DNA-PKcs由4 128個氨基酸組成，含有一個N端HEAT結構域，隨后是FRAP、ATM和TRRAP(FAT)結構域、激酶結構域和一個短C端區域稱為FATC結構域(圖1)[9]。N端HEAT結構域中的重復序列是DNA-PKcs所特有的，它和中間結構域M-HEAT形成螺旋，也稱為圓形支架，發揮著與Ku異二聚體及DNA末端結合的關鍵作用[10-11]。同時在M-HEAT結構域中，主要有兩個磷酸化位點簇，ABCDE(T2609、S2612、T2620、S2624、T2638和T2647)與PQR位點簇(S2023、S2029、S2041、S2051、S2053和S2056)[12-15]，分別以T2609與S2056位點為代表[16]。研究表明，當DNA-PKcs與Ku70/80及DNA末端結合后，ABCDE簇發生自磷酸化或被ATM磷酸化，使DNA-PKcs構象發生變化，激活內切酶Artemis對DNA末端剪切，促進DNA-PKcs的PQR發生自磷酸化，進而使DNA-PKcs與Ku蛋白復合體解離，釋放DNA-PKcs對DNA末端的物理阻斷，有利于DNA末端連接酶發揮作用[17]。

圖1 DNA-PKcs的結構[9]

由于DNA-PKcs相對分子質量太大，難以通過重組方式在細胞中表達，阻礙了其在細胞中功能的研究。通過對跨物種的DNA-PKcs序列分析，發現了高度保守且維持重要作用的氨基酸序列，其中包括M-HEAT結構域中的Forehead(892-1 289 aa)、NUC194(1 815-2 202 aa)和YRPD(2 772-2 784 aa)序列，以及FAT和激酶催化結構域[9]。值得注意的是，通過比對分析脊椎動物、無脊椎動物、變形蟲、卵菌、霉菌和植物的YRPD結構域，發現在不同物種中，其序列保持不變，表明它對DNA-PKcs的功能至關重要[18]。

2 DNA-PKcs在DSB位點的募集與激活

在NHEJ修復過程中，Ku70/Ku80通過識別DSB，包圍損傷DNA末端的15 bp，形成一個松散的環來啟動NHEJ，Ku蛋白對DSB的識別無序列特異性[19]。Ku蛋白結合到DNA末端后，促進DNA-PKcs在DSB位點的募集，DNA-PKcs與DNA末端結合后，將Ku異二聚體向DSB末端內部推進[20-21]。當DSB上無Ku蛋白，DNA-PKcs與DSB的親和力明顯降低，僅有約20%的結合，且DNA-PKcs激酶活性很低。當DSB上有Ku蛋白存在時，DNA-PKcs被募集至DNA末端，其活性增加5～10倍[22]。

DSB末端直接與DNA-PKcs的DNA末端結構域(DNA end binding，DEB)結合。DEB結構域是由DEB附加螺旋(DEBappended helix，DEB-A)(2 724-2 730 aa)、連接體(6個氨基酸)和DEB螺旋(2 736～2 767 aa)組成[9](圖2)。在脊椎動物中，Ku80包含1個C端區域(C-terminal region，CTR)和1個靈活的尾巴，對DNA-PKcs的激活發揮作用[23]。研究表明，DNA-PKcs與Ku80的C端保守序列EEGGDVDDLLDMI(720-732 aa)結合[24-25]，其中Ku80(725-731 aa)形成了1個離散的a-螺旋，與DNA-PKcs的NUC194結構域(1 815-2 202 aa)相互結合，從形成的復合體結構來看，DNA-PKcs的1 912～1 923 aa與1 955～1 970 aa之間的螺旋結構，很可能直接與Ku80 CTR結合[26]。

圖2 DNA-PKcs與DNA末端結合位點示意圖[9，26]

Ku異二聚體與DNA-PKcs組成DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)，是NHEJ修復通路的關鍵因子。Chaplin等[27]也發現了Ku80-CTR的類似結構特征，Ku80 CTR的尾部延伸到另一個損傷DNA末端的DNAPKcs分子中，這可能有助于兩個損傷DNA末端的連接。由DNA-PKcs、Ku70/80和dsDNA組成的復合物，包含兩個XRCC4同源二聚體，每個同源二聚體與一個Lig4分子結合，并通過它們的頭部結構域與單個XLF同源二聚體連接，形成遠程連接復合體[9]。這將有助于損傷的兩個DSB末端靠近排列，形成連接復合體，促進DSB末端的連接和保護，以避免異常降解或連接，同時DNA-PKcs被激活[26]。

3 DNA-PKcs在NHEJ修復中的作用過程

激活后的DNA-PKcs能夠使自身及相關修復因子磷酸化，其中ABCDE與PQR位點簇的自磷酸化對NHEJ修復發揮至關重要的作用[28]。電離輻射實驗結果表明，DNA-PKcs從DSB位點釋放，其半衰期約為1 h，但ABCDE與PQR位點簇中S2056突變為無法發生磷酸化的丙氨酸后，約60%的DNA-PKcs在誘導DSB后2 h，DNA-PKcs持續存在于DSB位點[29]，阻礙了連接酶對DSB的連接，抑制NHEJ修復[30]。在NHEJ修復過程中，DNA-PKcs的ABCDE與PQR位點簇，其自身構象如何變化，以及如何發揮功能，是多年來研究的熱點[23，27]。

DNA-PKcs的N-HEAT與M-HEAT各形成一個開環結構，與頂部相連。而FAT-Kinase-FATC區域位于開環結構的頂部，像一個王冠[11，27](圖3)。DNA-PKcs與DNA末端結合，并將Ku異源二聚體向內推進[20-21]。在激活過程中，DNA-PKcs的PI3K調節區域(PI3K-regulatory domain，PRD)旋轉115度，以暴露催化結構域中底物與ATP結合凹槽。PRD結構域在ATM和ATR激酶中也發揮類似作用，是PIKKs家族的一個共同特征[31]。PRD的旋轉和激酶結構域的提升，使N-HEAT和M-HEAT向催化結構域彎曲，類似于一個彎曲的膝蓋，ABCDE簇自磷酸化，使DNA末端暴露，這種構象允許DNA-PKcs將DNA末端呈現給其他NHEJ修復因子。如內切酶Artemis，對DNA末端(如發夾、5′或3′懸垂、氣泡和環等結構)進行適當剪切，便于末端連接，同時DNA-PKcs保護DNA末端免受其他因素損傷[15，31-32]。因此，激酶活性缺失或ABCDE的突變，會遮蓋DNA末端，以阻止NHEJ進程。如純化的DNA-PKcs未發生自磷酸化，將會阻斷T4連接酶介導的末端連接[33]。ABCDE簇除了分子間的自磷酸化(通過另一個的DNA-PKcs)，還可能是分子內的自磷酸化或被ATM磷酸化。

圖3 DNA-PKcs的結構和構象[11，27]

當DNA末端如發夾結構被Artemis等內切酶打開，促進DNA-PKcs的PQR位點簇自磷酸化，使DNA-PKcs被完全激活，PQR簇引入帶負電荷的磷酸基團，導致DEB/DEB-A通過電荷排斥DSB末端，使DSB末端從DEB中釋放，DNA-PKcs從DNA末端及Ku復合體中解離[9，17]。接下來，兩個DNA末端的Ku異二聚體與連接酶復合體XRCC4-DNA Ligase IV-XLFXRCC4-DNA Ligase IV形成短程連接復合體，使DSB末端水平對齊排列，易于連接酶復合體對損傷DNA末端連接，從而修復形成完整的DNA鏈[26]。DNA-PKcs自磷酸化觸發從遠程連接復合體到短程連接復合體的轉變[26]。DNA-PKcs保護DNA末端不被過早處理、連接和降解，直到兩個斷裂的末端被正確定位后，才從損傷DNA兩端解離，釋放物理空間，便于斷裂的DNA末端連接[34]。在NHEJ修復過程中，DNA-PKcs的自磷酸化，DNA末端加工和連接的協調均需高度調控，相關的具體機制尚待研究[9]。

4 DNA-PKcs與疾病

4.1 DNA-PKcs與腫瘤

DNA-PKcs參與了典型的腫瘤通路，包括DNA損傷檢查點調控、細胞周期控制、有絲分裂調控、微管動力學和染色體分離[35]。同時NHEJ是基因組重排的一個關鍵來源，并增加了細胞中惡性轉化的風險[36]。DNA-PKcs在腫瘤中發揮重要作用，特別是在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、胃癌(gastric carcinoma，GC)和結腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)中的研究比較廣泛，明確了DNA-PKcs在癌癥發生發展中的重要作用，有助于發現治療靶點和新的生物標志物。

DNA-PKcs與腫瘤發生的易感性相關。在537例結直腸癌病例中有72例(13.4%)發生DNA-PKcs突變，提示DNA-PKcs與結直腸癌的發生有關聯。Wang等[37]的癌癥病例表明，DNAPKcs可增加胰腺癌和乳腺癌的易感性。Zheng等[38]證實了DNAPKcs在腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)細胞中過表達。除上述癌癥外，也有報道稱食管癌中DNA-PKcs的表達增加[39]。

此外，DNA-PKcs通過刺激血管生成，促進腫瘤細胞增殖。DNA-PKcs在RCC細胞中過度異常表達，調節mTORC2 AKT活化、HIF-2a表達，促進RCC細胞增殖[38]。DNA-PKcs的藥理學或遺傳抑制，也可抑制RCC細胞的增殖。據報道，DNA-PKcs在大多數GC亞型中過度表達，并且DNA-PKcs敲除可導致增殖減少和細胞周期停滯[40]。

Sun等[41]報道DNA-PKcs的表達與臨床分期、淋巴浸潤、遠處轉移和5年生存率有關。癌組織中DNA-PKcs上調，DNAPKcs高表達的患者總體生存率較低。Zhang等[42]研究顯示DNAPKcs在多個乳腺癌亞型中過度表達，這與患者的低生存率相關。DNA-PKcs與GC患者低生存率相關[40]。因此，DNA-PKcs是腫瘤潛在的治療靶點。Davidson等[43]利用DNA-PKcs的小分子抑制劑NU7026和IC486241處理，可以顯著提高CRC細胞系中的療效。

4.2 DNA-PKcs與其他疾病

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)患者大腦皮質提取物中的NHEJ水平降低，同時AD腦提取物[44]中的DNA-PKcs水平顯著降低。在最近的一項研究中，亞致死水平的聚集Aβ，已被證明可以抑制PC12細胞中的DNA-PK活性，其中一個潛在的機制可能是Aβ介導的ROS，導致DNA-PKcs降解[45]。Aβ還能誘導DNA-PKcs碳基化，這是一種不可逆的蛋白氧化修飾，可能觸發蛋白酶體降解[46-47]。對于其他與DNA-PKcs一樣重要的NHEJ成分(如Ku，Artemis)，它們在AD中的作用仍未被闡明。

DNA-PKcs也與免疫相關。據報道顯示小鼠DNA-PKcs種系突變，導致嚴重的聯合免疫缺陷，選擇體細胞突變或小分子抑制劑使DNA-PKcs激酶失活，導致DSB修復缺陷，促進基因組不穩定性[48]。另外，DNA-PKcs可通過NF-κB通路，激活黏附分子VCAM和炎癥細胞因子TNF，促進先天性免疫與炎癥的發生[49]。

DNA-PKcs與衰老也具有相關性。研究表明，老年小鼠比年輕小鼠的細胞中含更多的DSB，在細胞衰老過程中，基因組的完整性和DNA損傷后NHEJ的修復效率顯著下降，導致與年齡相關的基因組不穩定及衰老的發生[50]。

5 結語

DNA-PKcs被認為是腫瘤進展和轉移的潛在驅動因素，可作為晚期惡性腫瘤的潛在治療靶點。目前DNA-PKcs的幾種選擇性小分子抑制劑Nedisertib、AZD7648、VX-984和CC-115已經進入臨床階段[47]。對NHEJ修復過程中，DNA-PKcs的結構變化、作用過程等的解析，不僅有助于研究NHEJ修復過程中的結構連接復合體，還可以靶向設計變構構象的NHEJ抑制劑，從而提高治療的特異性和治療潛力。此外，關于DNA-PKcs在腫瘤等疾病中的確切作用及其潛在的分子機制，目前仍不十分清楚，未來需要持續研究，以開發針對DNA-PKcs的臨床轉化應用。