豆甾醇通過抑制鈣離子內流抑制大鼠前列腺間質細胞收縮*

馬亞宣 ，吳垚鋅 ，邵瑞 ，苗琳

（1.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；3.方劑學教育部重點實驗室，天津 301617）

良性前列腺增生（BPH）是老年男性常見的泌尿系統疾病。臨床上BPH患者表現為尿頻、尿急、尿不盡等下尿路癥狀[1]（LUTS），嚴重影響老年男性的生活質量。前列腺腺體由上皮與間質兩部分組成，其中間質又包括平滑肌細胞和成纖維細胞兩種主要的細胞類型[2]。在BPH發生發展的過程中，前列腺體積增大，間質中的平滑肌細胞所占比例亦會增加[2]，并且伴隨有平滑肌細胞的過度收縮現象[3]。VK Lin等[4]指出，具有收縮活性并能夠增殖的平滑肌細胞存在于增生進程的早期，在增生晚期大多數平滑肌細胞不再具有增殖活性。這些病理改變最終導致尿道梗阻和膀胱功能的代償性改變[5]，引起LUTS。臨床上，多采用α受體阻滯劑聯合抗雄、抗雌藥物組合[6]，一方面抑制前列腺體積增大，另一方面調節平滑肌細胞的過度收縮。

平滑肌細胞多呈梭型，其肌漿中含有的肌動蛋白（Actin）和肌球蛋白（Myosin）是平滑肌收縮系統的重要組成部分。當平滑肌細胞收縮時，相鄰的Myosin以相反方向沿著Actin運動，通過相互作用而引起細胞收縮[7]。前列腺平滑肌的收縮主要是由細胞膜上的G蛋白偶聯受體α-腎上腺素受體（α-Adrenoceptor）介導，激活的 α-Adrenoceptor可以分別通過鈣離子（Ca2+）、蛋白激酶C（PKC）和Rho激酶介導的3條信號通路誘導前列腺平滑肌收縮[8]。其中，Ca2+信號通路在調控前列腺平滑肌收縮中發揮了重要的作用。細胞內Ca2+水平的升高可以增強前列腺平滑肌細胞的興奮性和收縮力[9]。目前已知，細胞內Ca2+的釋放和細胞外Ca2+的內流均可使Ca2+濃度增加，前者主要是通過細胞內的肌漿網釋放Ca2+參與肌肉收縮；后者則主要通過細胞膜上的Ca2+通道使Ca2+流入細胞內[10]。因此，調節前列腺平滑肌細胞內Ca2+內流抑制前列腺平滑肌的過度收縮在BPH的治療中具有重要意義。

豆甾醇又稱豆固醇，是一種植物甾醇，其廣泛存在于各類植物中，在植物油中含量最高，其次是大豆、谷物和堅果?，F代藥理學研究發現，豆甾醇具有抗炎[11]、抗氧化[12]、抗癌[13]、降低膽固醇[14]等多種藥理學作用，是一類極具研發價值的藥用植物甾醇。結構式見圖1。近年來，有臨床研究證實，植物甾醇有抑制前列腺肥大和改善膀胱收縮的效果，對尿頻、夜間尿頻、膀胱受迫、排尿障礙癥狀有明顯的改善效果[15]。但是，豆甾醇對前列腺增生和前列腺平滑肌收縮的影響尚未見報道。本文研究豆甾醇對大鼠原代前列腺間質細胞收縮功能的影響，并進一步研究該作用是否與鈣離子信號通路有關，旨在闡明豆甾醇調控前列腺平滑肌舒縮作用的分子機制，為豆甾醇作為治療前列腺增生的候選藥物提供實驗依據。

圖1 豆甾醇的結構式Fig.1 Structure of stigmasterol

1 實驗動物與材料

1.1 動物 Wistar大鼠，雄性，體質量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司。許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 藥物 豆甾醇（批號：83-48-7）購自成都埃法生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與試劑 細胞CO2培養箱購自美國Thermo scientific公司；離心機購自德國Eppendorf公司；超凈工作臺購自中國海爾股份有限公司；酶標儀購自北京海天友誠科技有限公司；實時定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Nikon倒置顯微鏡購自北京恒三江儀器銷售有限公司；臺式震蕩培養箱購自伊孚森（中國）生物技術有限公司；流式細胞儀FACS Calibur購自美國BD biosciences公司；熒光共聚焦顯微鏡購自美國BioTek公司。

胎牛血清（FBS，貨號：F95551243）購自美國Invigentech公司；青鏈霉素混合液（PS，貨號：2033117）、0.25%的胰蛋白酶 （貨號：2133226）和DMEM培養液（貨號：2050238）購自以色列BI公司；鬼筆環肽（貨號：YP0059）購自蘇州宇恒生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒（貨號：C6005）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（貨號：CK12）購自日本Dojindo Lab公司；鼠尾膠原蛋白溶液（貨號：354236）購自美國Corning公司；RNA提取試劑盒（貨號：19211ES60）購自天津翌圣生物科技有限公司；反轉錄試劑盒（貨號：AT341-02）購自北京全式金生物科技有限公司；實時熒光定量核酸擴增系統（qPCR）試劑盒（貨號：A6001）購自美國 Promega公司；轉化生長因子-β（TGF-β1）（貨號：96-100-21-10）購自派普泰克生物科技（蘇州）有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（貨號：BM0002）購自博士德生物；GAPDH抗體（貨號：60004-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術有限公司；極敏型ECL發光液（貨號：KF003）購自英國Affinity公司；氯化乙酰膽堿（貨號：A6625）購自美國Sigma公司；鈣熒光探針（貨號：F8840）購自北京Solarbio科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 大鼠離體前列腺間質細胞的制備與培養 Wistar大鼠安樂死后，仰位固定，用眼科剪和眼科鑷逐層打開大鼠腹腔，分離并取出大鼠前列腺組織，放入預冷的含青鏈霉素的1×D-Hank’s溶液中；在超凈臺上，用無菌眼科剪和眼科鑷剝離前列腺周圍脂肪和結締組織，清洗3次后用手術剪剪碎前列腺組織；加入 5 mL 的 1×D-Hank’s溶液，1 000 r/min 常溫離心3 min（離心半徑8.6 cm，下同）；沉淀加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶，于37℃搖床中消化60 min；再加入4 mL含15%FBS和1%PS的DMEM培養液終止消化，用70μm的篩網過濾混懸液3次，1000r/min常溫離心8 min；棄上清，沉淀用4 mL含15%FBS和1%PS的DMEM培養液重懸，加入鋪有鼠尾膠原（25 μg/mL）的 25 cm2培養瓶中，置 5%CO2培養箱中37℃培養72 h。待細胞生長至80%融合時，傳代1次。

2.2 大鼠原代前列腺間質細胞表型的鑒定 大鼠原代前列腺間質細胞生長至2～3代時，以每孔1×105個細胞鋪至24孔板，37℃培養箱中培養24 h后，棄去孔內培養液，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛冰上固定細胞15 min，棄去多聚甲醛，PBS洗3次，室溫下用0.5%Triton X-100透化10 min，PBS洗3次后，用鬼筆環肽染液室溫孵育20 min。PBS 洗 3 次，加入 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液室溫孵育20 min，熒光顯微鏡觀察染色情況。

2.3 細胞增殖和細胞毒性檢測 取對數生長期的大鼠原代前列腺間質細胞，以8×103/孔的密度接種于96孔板中，培養24 h使細胞完全貼壁。棄掉培養液，加入不同濃度的豆甾醇（0.1、0.5、1、5、10 μmol/L），繼續培養24 h。檢測細胞增殖時，按照CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h后，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔吸光度值。檢測細胞毒性時，按照LDH試劑盒說明書每孔加100 μL LDH工作液，避光孵育15 min，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔吸光度值，確定豆甾醇的最大無毒作用劑量。

2.4 膠原凝膠收縮實驗 取對數生長期的大鼠原代前列腺間質細胞，1×D-Hank’s洗兩遍，用0.25%的胰蛋白酶消化后，用含鼠尾膠原的不含/或含血清的DMEM培養液重懸細胞，制備細胞終濃度為6×104個/mL、鼠尾膠原濃度為1 mg/mL的細胞-膠原混合物，24孔板中每孔加500 μL，室溫下放置20 min。待膠原凝固后，分別加入DMEM、含15%FBS的DMEM或用含15%FBS的DMEM配制的豆甾醇（終濃度為 0.1、1、10 μmol/L）。輕輕分離凝膠與孔板，確保凝膠能夠在孔板內自由移動，在加藥0 h及24 h時觀察與拍照。

2.5 RT-PCR檢測 取3～5代的大鼠原代前列腺間質細胞，以3×105/孔的密度接種于6孔板中，培養24 h使細胞完全貼壁，加入1 μmol/L豆甾醇繼續孵育24 h后，按照RNA提取試劑盒說明書，提取細胞RNA；用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA模板；使用 SYBR-Green 擴增 cDNA，通過 2－ΔΔCt法計算目的基因α-SMA和Collagen I mRNA水平的表達情況，GAPDH為內參基因，具體引物序列如下。α-SMA：5’-GGACGTACAACTGGTATTGTGC-3’，5’-TCGGC AGTAGTCACTAAGGA-3’；CollagenI：5’-GCTCCTCT TAGGGGCCACT-3’，5’-ATTGGGGACCCTTAGGCC AT-3’，GAPDH：5’-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3’，5’-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3’。

2.6 蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測 將3～5代的大鼠原代前列腺間質細胞以每孔3×105接種至6孔板，貼壁后分別加入10 ng/mL TGF-β1或TGF-β1+1 μmol/L豆甾醇，處理48 h后棄去上清，用PBS溶液洗2次，用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞，加入含有PMSF及蛋白酶抑制劑的預冷的RIPA裂解液，裂解細胞，冰上靜置 30 min，13 000 r/min、4 ℃離心20 min，吸取蛋白上清液用BCA法測定濃度。用Western Blot法檢測細胞中α-SMA蛋白的表達。將15 μg/孔的蛋白上樣到10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉至 0.22 μm 的 PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入α-SMA抗體（1∶1 000稀釋），4℃過夜，用 TBST洗一抗 30 min后，加入TBST稀釋的二抗（1∶5 000稀釋）孵育1 h，洗膜后用化學發光試劑盒檢測化學發光。

2.7 鈣離子濃度的檢測 大鼠原代前列腺間質細胞生長至3～5代時，以每孔6×105個細胞鋪于6孔板，37℃培養24 h，棄去培養液，用HBSS溶液洗3 次，加入 1.5 μmol/L Fluo-3，AM 工作液，37 ℃孵育20 min后，加入2.5 mL含有1%FBS的HBSS溶液，37℃孵育40 min，棄去細胞上清液，HEPES溶液洗3次，用0.25%的胰蛋白酶消化，用HEPES溶液重懸細胞并計數，用3×105個/mL的濃度上流式細胞儀檢測。流式細胞儀參數設置見表1。

表1 流式細胞儀參數設置信息Tab.1 Parametersin flow cytometry assay

2.8 統計方法 使用Graphpad Prism 8.0.1軟件分析，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠原代前列腺間質細胞的培養與鑒定 鬼筆環肽可以特異性與平滑肌細胞的標記蛋白F-肌動蛋白（F-actin）結合，因此用鬼筆環肽染色法可以鑒定平滑肌類型細胞。培養的大鼠原代前列腺間質細胞經鬼筆環肽染色后可見F-actin高表達（綠色熒光）；Image J統計F-actin陽性染色細胞比例約為79.29%，提示經原代培養的大鼠前列腺間質細胞多為平滑肌細胞。見圖2。

圖2 大鼠原代前列腺間質細胞的鑒定Fig.2 Identification of smooth muscle cells in rat primary prostatic stromal cells

3.2 豆甾醇對大鼠原代前列腺間質細胞活力的影響 不同濃度的豆甾醇處理前列腺間質細胞后，用CCK8法檢測藥物對細胞活力的影響，結果顯示各給藥組OD450數值與對照組相比無顯著性差異（見圖3A）；進一步檢測不同濃度的豆甾醇對前列腺間質細胞分泌LDH的影響，結果顯示各給藥組OD490數值與對照組相比亦無明顯增加，反而在0.1、0.5和1 μmol/L濃度時可以抑制LDH的生成（見圖3B），提示濃度低于10 μmol/L時，豆甾醇對前列腺間質細胞的活力無明顯抑制作用，且無毒性。

圖3 豆甾醇對大鼠前列腺間質細胞活力和毒性的影響（±s，n=6）Fig.3 Effects of stigmasterol on cell viability and toxicity in rat primary prostatic stromal cell（±s，n=6）

3.3 豆甾醇抑制大鼠前列腺間質細胞的收縮 膠原凝膠收縮實驗結果顯示，含15%胎牛血清的培養液可以誘導前列腺間質細胞的收縮，而加入豆甾醇處理24 h后收縮作用被明顯抑制。并且豆甾醇在濃度10 μmol/L時抑制作用最為明顯，抑制率為77.1%（P<0.05）。

圖4 豆甾醇對膠原凝膠中大鼠前列腺間質細胞收縮能力的影響（±s，n=3）Fig.4 Effect of stigmasterol on the contractility of rat prostatic stromal cells in collagen gel（±s，n=3）

3.4 豆甾醇抑制大鼠前列腺間質細胞中α-SMA和CollagenⅠ表達 與對照組相比，1 μmol/L的豆甾醇可以顯著抑制大鼠前列腺間質細胞收縮功能相關的α-SMA和Collagen I mRNA水平的表達。見圖5。

圖5 豆甾醇對大鼠前列腺間質細胞中α-SMA和CollagenⅠmRNA 表達的影響（±s，n=3）Fig.5 Effect of stigmasterol on α-SMA and CollagenⅠmRNA expressionin rat prostatic stromal cells（±s，n=3）

3.5 豆甾醇抑制TGF-β1誘導的大鼠前列腺間質細胞中α-SMA的表達 10 ng/mL的TGF-β1可以明顯促進大鼠前列腺間質細胞中α-SMA蛋白的表達；1 μmol/L的豆甾醇可以抑制TGF-β1誘導的前列腺間質細胞α-SMA蛋白表達的升高。見圖6。

圖6 豆甾醇對TGF-β1刺激的大鼠前列腺間質細胞α-SMA表達的影響Fig.6 Effect of stigmasterol on TGF-β1 stimulated α-SMA expression in rat prostatic stromal cells

3.6 豆甾醇抑制ACh誘導的大鼠前列腺間質細胞內鈣離子內流 用流式細胞技術檢測大鼠前列腺間質細胞內鈣離子濃度變化，經ACh刺激后大鼠前列腺間質細胞內鈣離子濃度明顯升高；豆甾醇可有效抑制ACh誘導的細胞內鈣離子濃度的升高。作為對照，單獨給藥豆甾醇不會引起前列腺間質細胞內鈣離子濃度變化。見圖7。

圖7 豆甾醇對大鼠前列腺間質細胞Ca2+濃度的影響Fig.7 Effect of stigmasterol on intracellular Ca2+concentration in rat prostatic stromal cells

4 討論

前列腺間質細胞中平滑肌過度收縮是造成BPH相關LUTS的主要原因之一。本實驗觀察了豆甾醇對大鼠前列腺間質細胞收縮作用的影響，發現豆甾醇可明顯抑制血清誘導的膠原凝膠中前列腺間質細胞的收縮；基因表達方面，豆甾醇可以抑制本底水平以及TGF-β1誘導的收縮相關基因的α-SMA和CollagenⅠ的表達；進一步檢測鈣離子濃度證實豆甾醇可以抑制ACh刺激的細胞內鈣離子濃度的增加。

鈣離子信號通路與細胞收縮調控關系密切。有報道指出，前列腺中平滑肌可以通過α-Adrenoceptor打開細胞膜上的電壓依賴性鈣通道，使Ca2+內流增加[16]；與鈣調蛋白結合[17]后作用于肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），催化肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，引起前列腺平滑肌的收縮[8]。本研究發現，豆甾醇抑制前列腺間質細胞收縮以及抑制ACh誘導的大鼠前列腺間質細胞鈣離子內流。值得注意的是，PKC和Rho激酶通路亦可以促進MLC磷酸化而產生收縮效應[18]。然而豆甾醇是否可以通過其他非鈣離子依賴的信號通路調節前列腺間質細胞的收縮尚不清楚。

植物甾醇尚無毒副作用的報道，常作為一種食品添加劑和保健食品原料進行開發、利用[19]。在歐洲傳統療法中常作為天然保健藥用于治療前列腺肥大癥[15]。以β-谷固醇、豆固醇、菜子固醇等為主要成分的植物甾醇廣泛存在于各種植物油、植物種子、花粉中[20]。研究顯示，植物甾醇可以通過抑制促炎因子的表達以及p38 MAPK信號通路的激活抑制大鼠慢性非細菌性前列腺炎[21]。也有臨床研究證實，β-谷甾醇具有抑制前列腺肥大、改善膀胱收縮的功效[15]，但其作用機制尚未明確。目前，關于豆甾醇在前列腺疾病中的作用尚不清楚。已有的報道發現豆甾醇具有抗氧化、抗炎、抗癌的活性[12]。

Li等[22]發現，豆甾醇可以通過抑制氧化應激相關標志物活性氧的產生，增加超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性發揮抗氧化作用；同時，Liang等[23]發現豆甾醇還可以通過減少氧化應激和炎癥對腦缺血/再灌注損傷大鼠發揮保護作用。Ahmad等[24]發現，豆甾醇可以通過抑制促炎細胞因子人腫瘤壞死因子α、白介素-6、白介素-1β、誘導型一氧化氮合成酶和環氧合酶-2的表達，同時上調抗炎細胞因子白介素-10的表達發揮抗炎作用。此外，Zhao等[25]發現豆甾醇可以通過阻斷蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路誘導細胞凋亡和自噬發揮抗癌作用。在豆甾醇調節鈣離子通路方面，有報道指出[26]豆甾醇可以刺激菜豆根對鈣離子的吸收并誘導鈣調素的合成。李慶勇等[27]研究發現豆甾醇可以通過上調人肝癌細胞SMMC-7721內的鈣離子濃度，阻滯細胞周期的不同階段而誘導細胞發生凋亡。在豆甾醇對細胞收縮的影響方面，有報道指出，豆甾醇對血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠胸大動脈平滑肌細胞A7r5有顯著的抑制作用[22]。本研究首次發現豆甾醇可以抑制前列腺間質細胞的收縮，降低收縮相關蛋白α-SMA和CollagenⅠ的表達，并且可以抑制ACh誘導的前列腺間質細胞鈣離子濃度的升高。這些結果表明，豆甾醇可以作用于前列腺間質細胞，抑制前列腺間質的過度收縮，其機制與抑制鈣離子內流有關，提示豆甾醇可能通過調節前列腺間質細胞收縮狀態而抑制BPH，是臨床治療BPH的潛在候選藥物。