經方麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯減輕膜性腎病小鼠氧化應激損傷的機制研究*

黃山，劉納文，郝陽

（天津市第一中心醫院中醫科，天津 300192）

膜性腎?。∕N）又名膜性腎小球腎炎，其特征表現以高脂血癥、大量蛋白尿、水腫、低蛋白血癥等為主，以腎小球基底膜上皮細胞下彌漫的免疫復合物沉積伴基底膜彌漫增厚為病理特點[1]，是一類特殊的原發性腎小球病變病理類型，是成人特發性腎病綜合征最常見病因[2]。近年來越來越多的證據表明，MN發病機制與氧化應激有著直接關系，而且該因素的占比較高[3-4]。對于MN西醫多使用激素以及免疫抑制劑（如環磷酰胺等）加以防治，但往往會產生皮質功能亢進、引起或加劇感染、骨髓控制、胃腸道癥狀、泌尿道癥狀等較多的不良反應，且部分病人不能耐受，單純西醫治療具有一定局限性。

MN在中醫中并沒有切確的病名，根據病癥表現的特點可將之歸屬于中醫的“水腫”“尿濁”“膏淋”“虛勞”等疾病范疇。通過門診診治大量MN患者，總結本病的中醫辨證特點，筆者認為少陰樞機不利為本病病機之關鍵，因而提出從少陰樞機論治膜性腎病的學術觀點，臨床上常選用麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯加減進行治療并取得了較好的療效。本研究觀察麻黃附子細辛湯聯合防己黃芪湯通過減輕腎臟氧化應激反應及炎癥反應并參與調控核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路發揮治療作用，以期為中醫藥治療MN的臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性Balb/c小鼠60只，6～8周齡，平均體質量20～25 g，購于斯貝福（北京）生物技術科技公司。

1.2 藥品與化學試劑 中藥（防己10 g，黃芪20 g，白術 10 g，麻黃 10 g，制附子 10 g，細辛 3 g，炙甘草3 g），以上藥品均由江陰天江藥業有限公司生產供應，由天津市第一中心醫院中醫科統一制備。TBD氨基載玻片FISH0010，天津市智恩博萊生物科技有限公司生產；陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）（Chondrex公司）、氟氏不完全佐劑，購于天津市南開區艾博抗生物試劑銷售中心；三酰甘油（TG）檢測盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測盒、總膽固醇（T-CHO）檢測盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測盒，南京建成生物工程研究所生產；超氧化物歧化酶（SOD）酶聯免疫分析試劑盒，丙二醛（MDA）酶聯免疫分析試劑盒、白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫分析試劑盒、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）酶聯免疫分析試劑盒，上海泛柯實業有限公司生產；即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司生產；DAB顯色試劑盒ZLI-9032 3 mL（20×），中杉金橋；兔多抗 NF-κB，北京博奧森生物科技公司生產。

1.3 主要儀器 TJP-01型排毒柜，天津市超純凈化設備廠工程部生產；電熱干燥箱DG-204，天津天宇技術實業有限公司；石蠟切片機（RM2235），德國Leica集團；光學顯微鏡（BA410），Moticam Pro集團；LX-200迷你離心機，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組 60只Balb/c小鼠，按體質量分層隨機分為正常組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，各12只。

2.2 造模與干預 適應性喂養1周后，用C-BSA制成膜性腎病小鼠模：C-BSA 1 mg，加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，在同量的氟氏不完全佐劑中混勻配制為懸濁液，在小鼠的腹股溝處、雙側腋下多點皮下注射，每只注射0.3 mL，每日1次；正常組等容積的生理鹽水與弗氏不完全佐劑，按上述比例乳化后進行腹股溝處、雙側腋下多點皮下注射。1周后每只小鼠尾靜脈內注射C-BSA 20 mg/kg，隔日1次，4周后驗證模型復制成功[5]。于造模完成后開始灌胃治療，向中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組依次灌服標準中藥溶液（1、2、4 g生藥/mL），正常組和模型組灌服等量的生理鹽水，共6周。（60 kg成人的中藥治療用量大約為每日65 g生藥，按體表面積，小鼠單位體質量的等效用量大約為成人用量的9.1倍，從而確定了每天對每只小鼠的灌胃劑量，每周測小鼠體質量進行藥量調節。成人用量1.08g生藥/kg，小鼠的等效用量為9.83 g生藥/kg，20 g小鼠按中藥濃度1 g生藥/mL，每日需灌藥約0.2 mL）。

2.3 標本采集和處置方法 灌胃治療6周后，摘眼球取血法，室溫度下保存30 min后，以7 000 r/min離心15 min，離心半徑4 cm。采集上層的血清，于-80℃以下保存。取血后動物取出腎臟組織，將腎臟沿冠狀面切成大致相等的兩半，用生理鹽水多次沖洗腎臟以洗去腎臟組織的血液，用濾紙片吸干水分，再將一半腎臟置于液氮瓶中封存，用于檢測SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量；另一半放于中性福爾馬林中固定，用以制作病理切片。

2.4 指標檢測

2.4.1 血脂及腎功能的測定 全自動生化分析儀測定各組小鼠血清白蛋白（ALB）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）的水平。

2.4.2 腎臟病理 取固定好的腎組織，用石蠟包埋法，厚度為5 μm，將其進行腎組織蘇木精-伊紅（HE）染色和過碘酸雪夫（PAS）染色，中性樹膠封閉，光鏡下觀察照相。

2.4.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測腎臟組織SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量表達 按ELISA試劑盒說明書操作。

2.4.4 免疫組化法觀察NF-κB蛋白的表達 具體按SABC免疫組化染色試劑盒使用說明完成。

2.5 統計學方法 數據處理使用IBM SPSS statistics 22軟件完成計量資料數據均以均數±標準差（±s）表示，多組間的比較使用單因素方差分析（one way-ANOVA），組間兩兩比較使用SNK-q檢驗。P<0.05代表差異具有統計學意義。免疫組化結果采用Image-Pro Plus 6.0軟件系統完成數據分析，使用積分光密度值分析法。

3 實驗結果

3.1 中醫經方麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對膜性腎病小鼠TG、TC、ALB、SCr、BUN水平的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、SCr、BUN水平上升（P<0.01），ALB 水平下降（P<0.01），差異具有統計學意義；與模型組比較，中藥低中高各劑量濃度組TG、TC水平各有不同程度的下降，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），ALB水平提高，差異具有統計學意義（P<0.01），血清SCr、BUN水平差異無統計意義（P>0.05）。見表1。

表1 麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對MN小鼠TG、TC、ALB、SCr、BUN水平的影響（±s）Tab.1 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on TG，TC，ALB，SCr，BUN level of MN mice（±s）

表1 麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對MN小鼠TG、TC、ALB、SCr、BUN水平的影響（±s）Tab.1 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on TG，TC，ALB，SCr，BUN level of MN mice（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動物數TG（mmol/L）TC（mmol/L）ALB（g/L）SCr（mmol/L）BUN（mmol/L）正常組 12 1.27±0.17 2.41±0.45 39.66±2.66 6.25±1.96 9.63±1.59模型組 12 1.96±0.15** 3.39±0.39** 30.58±1.18** 14.75±1.82** 18.54±1.46**中藥低劑量組 12 1.70±0.18## 2.99±0.43# 34.98±1.87## 13.67±1.92 17.55±1.96中藥中劑量組 12 1.58±0.18## 2.93±0.52# 37.99±1.55## 13.58±1.98 17.53±1.58中藥高劑量組 12 1.52±0.18## 2.80±0.40## 38.29±1.94## 13.50±1.51 17.31±1.08

3.2 經方麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對膜性腎病小鼠腎組織病理形態學（HE染色、PAS染色）的影響 正常組小鼠腎臟組織被膜結構比較完好，沒有發現炎性滲出或者結締組織增生，其髓質與皮質的界線也較清晰，皮質區腎小球內未見毛細血管基底膜以及基質增生；腎小管結構基本完整，上皮細胞沒有出現變性壞死，沒有發現間質內炎癥細胞浸潤現象且無充血。與正常組比較，模型組小鼠的腎組織皮質腎小球結構模糊不清，基底膜增厚，由單層變為多層，細胞胞核腫脹，周圍腎小管腫脹，部分變性壞死。與模型組相比較，中藥的低、中、高劑量濃度組小鼠腎臟組織被膜較為完整，皮質與髓質之間分界也較為清晰，皮質腎小球結構模糊，但基底膜增厚程度有改善，部分腎小管變性。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織病理改變HE染色（×400）Fig.1 HE staining of renal histological changes of mice in each group(×400)

正常組小鼠腎組織未見明顯纖維膠原物質生成，腎小球細胞也未見纖維化樣變。但與正常組相比較，模型組的小鼠腎小球構造紊亂，體積增大明顯，球囊毛細血管基底膜增厚，腎小球上皮下出現嗜復紅蛋白和膠原纖維的沉積，腎小管上皮細胞數量明顯減少，可見膠原纖維的沉積，部分出現空泡樣變性；與模型組相比較，中藥低、中、高劑量組小鼠的腎小球和腎小管結構都有了不同程度的改善。見圖2。

圖2 各組小鼠腎組織病理改變PAS染色（×400）Fig.2 PAS staining of renal histological changes of mice in each group(×400)

3.3 經方麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對膜性腎病小鼠腎組織 SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量的影響 與對照組比較，模型組的小鼠腎臟組織SOD下降（P<0.01），MDA、IL-6、MCP-1 數值升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組腎組織SOD含量均有不同程度的增加（P<0.05或P<0.01），差異具有統計學意義，MDA、IL-6、MCP-1 含量均下降（P<0.01），差異具有統計學意義。見表2。

表2 麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對MN小鼠腎組織SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on SOD，MDA，IL-6，MCP-1 level in kidney of MN mice（±s）

表2 麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對MN小鼠腎組織SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on SOD，MDA，IL-6，MCP-1 level in kidney of MN mice（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組 動物數 SOD（pg/mL） MDA（nmol/L） IL-6（pg/ml） MCP-1（ng/L）正常組 12 17.92±0.57 18.31±0.54 27.57±1.50 285.13±12.96模型組 12 10.56±0.63** 29.56±0.49** 48.21±0.80** 519.67±21.79**中藥低劑量組 12 11.07±0.75# 27.13±0.37## 40.46±1.17## 447.52±17.03##中藥中劑量組 12 13.23±0.27## 24.56±0.59## 36.49±0.96## 355.04±14.59##中藥高劑量組 12 14.73±0.50## 22.22±0.34## 30.17±1.20## 328.14±14.73##

3.4 經方麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對膜性腎病小鼠腎組織NF-κB蛋白表達的影響 光鏡下觀察組織切片免疫組化染色結果，NF-κB蛋白陽性表達主要位于小鼠腎小管及腎小球球囊，呈現出圓圈狀或團狀的棕褐色著染，且分布范圍廣泛。正常組腎小管和腎小球球囊呈現的棕褐色著染比較少，與正常組相比，模型組NF-κB蛋白陽性表達明顯增加，棕褐色著染變深，范圍更大；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組棕褐色著染依次變淺，范圍依次遞減。見圖3。

圖3 經方麻黃附子細辛湯合防己黃芪湯對MN小鼠腎組織NF-κB蛋白表達的影響（×400）Fig.3 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on NF-κB protein expressions in kidney of MN mice(×400)

各組中陽性表達的積分光密度值（IOD）統計學分析顯示：與正常組比較，模型組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達升高（P＜0.01），差異具有統計學意義；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達均有不同程度的下降（P<0.05或P<0.01），差異具有統計學意義。見表3。

表3 各組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達情況（IOD值，±s）Tab.3 Expression of NF-κB protein in renal tissue of mice in each group(IOD value，±s)

表3 各組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達情況（IOD值，±s）Tab.3 Expression of NF-κB protein in renal tissue of mice in each group(IOD value，±s)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別 動物數 NF-κB正常組 12 97 416.77±79.94模型組 12 122 082.31±54.60**中藥低劑量組 12 107 680.76±49.82##中藥中劑量組 12 81 120.63±35.96##中藥高劑量組 12 70 764.18±42.07##

4 討論

麻黃附子細辛湯出自《傷寒論·辨少陰病脈證并治》，“少陰病，始得之，反發熱，脈沉者，麻黃附子細辛湯主之”，有助陽解表之功。防己黃芪湯出自《金匱要略·痙濕暍病脈證并治》，“風濕，脈浮身重，汗出惡風者，防己黃芪湯主之”，有益氣祛風，健脾利水之效。麻黃附子細辛湯溫少陰而解表，益火之源壯少陰樞機使陰陽調和，并以汗法開鬼門以消水腫；防己黃芪湯健脾利水，益氣祛風。兩方聯合治療以少陰樞機不利為病機的膜性腎病，既能扶正固本，溫陽補脾腎益氣，又能對癥去標，祛風除濕利水，標本兼顧，在臨證中取得了良好的療效。

MN的發病機制與氧化應激有著重要關系[4-5]。首先，氧化應激能夠直接損害腎臟從而誘導膜性腎病的發生：氧化應激通常伴隨著活性氧（ROS）生成的增多和抗氧化分子的生成下降，而ROS則能使脂質、蛋白質和核酸等重要細胞分子過氧化，從而使細胞的結構、功能出現損傷，對腎臟功能有直接破壞作用，從而參與MN的病理形成過程。其次，氧化應激還可以激活相應的信號通路（如NF-κB信號通路）介導免疫炎癥反應促進膜性腎病的發生發展。NF-κB是導致相應炎癥因子基因表達的主要起始因子，調控了一系列趨化因子和黏附分子物質的表達，如IL-6、MCP-1等，這些因子參與免疫和炎癥細胞的趨化、浸潤、增殖、分化過程，同時也能夠反過來刺激NF-κB的活化，而這種正反饋效應使得炎癥反應信號進一步釋放，促進炎性反應，進而加重了腎臟組織損害[6-7]。本研究從中醫經方麻黃附子細辛湯聯合防己黃芪湯可能通過減輕腎臟氧化應激反應及炎癥反應并參與NF-κB信號通路發揮對MN的治療作用這一假說出發，通過觀察腎臟組織中氧化應激反應相關蛋白SOD、MDA和炎癥反應相關蛋白IL-6、MCP-1含量，及腎組織NF-κB蛋白表達的影響，以證實假說的真實性。

本研究結果發現經方麻黃附子細辛湯聯合防己黃芪湯可有效降低MN小鼠血清TG、TC水平，能夠使血漿白蛋白水平提高，但不會改變腎功能相關指標如SCr、BUN的數值，從而得出結論：中醫經方麻黃附子細辛湯聯合防己黃芪湯具有改善脂代謝紊亂和低蛋白血癥的作用，但對腎功能無明顯改善作用，這與以往學者研究麻黃附子細辛湯或防己黃芪湯單方作用的研究結果相似[8-10]。經過逐層剖析兩方合用治療MN的作用途徑可以看到：首先，兩方合用能有效改善脂質代謝紊亂，使得血漿白蛋白水平變高，從而減少高脂血癥、低蛋白血癥發生，減輕水腫癥狀；其次能有效改善膜性腎病腎臟病理形態，從而減輕病變程度，延緩病程進展；再次，兩經方合用可以使MN小鼠的氧化應激反應和炎癥反應減低，并抑制NF-κB通路，從中醫宏觀思維與西醫微觀思維相互聯系的角度看，可以猜測這很可能是二聯方緩解MN病理的最可能內在分子作用機制，而氧化應激反應、炎癥反應以及NF-κB通路的激活等病理機制，是中醫病機里“水濕、濕熱、濁毒”等潛在的微觀病理表現，由它所產生的抑制NF-κB通路、降低氧化應激反應和炎癥反應是扶正固本、祛風除濕利水、化濁毒的內在分子層面的表現。

同時筆者也認識到本課題研究中存在的不足之處，如經方麻黃附子細辛湯聯合防己黃芪湯對MN的作用機制只是初步的研究，其到底是如何發揮抑制氧化應激反應和炎癥反應作用的，其具體機制有待進一步研究探討。同時，在抑制氧化應激反應和炎癥反應之間有沒有潛在的內在分子聯系，需要進一步證實。中醫藥防治MN具有廣闊的研究前景和應用價值，相信在未來會看到更多的突破性進展和成果。