食管鱗狀細胞癌中HIF-1α、CTSD表達和血管生成擬態的關系及其臨床意義

徐林生

（武漢市黃陂區人民醫院，江漢大學附屬黃陂區人民醫院，湖北 武漢 430300）

食管鱗狀細胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC) 是近年來臨床上發病率持續升高的一種疾病。在發生該疾病的期間，腫瘤血管生成會為腫瘤的轉移、復發提供一定的基礎[1]。血管生成理論認為，當實體腫瘤直徑大于2 mm 時需要誘導生成新的血管來獲取血供，否則腫瘤就會因為缺血缺氧發生壞死。腫瘤誘導的血管生成主要步驟包括：腫瘤經過無血管的緩慢生長期后( 指體積小于2 mm 時期)，便釋放多種血管生成因子，引起血管內皮細胞形態改變，基底膜及周圍的細胞外基質降解，內皮細胞遷移、增殖，血管形成、改建。目前抗血管生成已經成為腫瘤治療的一種新手段。在1999 年有學者根據對人眼葡萄膜黑色素瘤微循環的研究，首次提出了一種與經典腫瘤血管生成途徑不同，不依賴機體內皮細胞的全新腫瘤微循環模式，即血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM) 的概念。血管生成擬態是一種腫瘤細胞供血模式，在形成血管生成擬態時會有多種因子參與，比如血管內皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α) 等[2]。組織蛋白酶D(cathepsinD,CTSD) 是一種天門冬氨酸水解酶，它的作用是降解細胞基膜、降解細胞外基質等，它在腫瘤發生、發展期間起到了非常重要的作用[3]。此次我院對食管鱗狀細胞癌中HIF-1α、CTSD 表達和血管生成擬態的關系進行了研究，發現HIF-1α 與CTSD 表達存在一定的關系，CTSD 表達和血管生成擬態也存在一定的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年2 月至2018 年2 月我院收治的食管鱗狀細胞癌患者130 例，對患者的HIF-1α、CTSD 表達水平進行檢測與分析。主要是收集了在我院進行食管鱗狀細胞癌手術切除標本的患者130 例，選取標準：1）患者在術前接受了活檢，無相關家族病史；2）均是在我院接受食管鱗狀細胞癌手術切除的患者；3）術后經病理診斷確診為食管鱗狀細胞癌；4）年齡均在40 ～80 歲之間；5）腫瘤無遠處轉移；6）術前未進行過放化療；7）隨訪患者死于食管癌或者是相關疾病；8）患者均知曉同意此次研究。排除標準：1）術前接受放化療治療的患者；2）精神異常的患者；3）合并有其他惡性腫瘤的患者；4）術后病理未確診為食管癌；5）蠟塊保存不完整；6）隨訪資料不完整。130 例患者中有男88 例，女42 例；年齡43 ～78 歲，平均年齡（67.4±4.1）歲；腫瘤分化程度：低分化27 例，中分化65 例，高分化38 例。腫瘤浸潤程度：浸潤至深肌層及外膜層55 例，浸潤至黏膜層及淺肌層75 例。淋巴結轉移情況：無轉移80 例，轉移50 例。病理分級：共3 級，光鏡檢查下特征為：Ⅰ級：存在明顯的癌珠或者是角化；Ⅱ級：存在少許癌珠或者是角化，形狀為多角形、圓形、卵圓形，最常見的為核分裂；Ⅲ級：無癌珠或者是角化，癌細胞為規則形、卵圓形、索形，索形較少，最常見的為核分裂。Ⅰ級為高分化，Ⅱ級為中分化，Ⅲ級為低分化。其中Ⅰ級34 例、Ⅱ級56 例、Ⅲ級40 例。腫瘤分期：Ⅰ期26 例，Ⅱ期47 例，Ⅲ期57 例。無脈管癌栓形成72 例，脈管癌栓形成58 例，經過病理檢查排除腫瘤累及。研究在我院倫理委員會得到了批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑HIF-1α、CTSD、鼠抗人單克隆抗體CD34（北京中杉金橋公司生產），PAS 染色試劑盒（上海貝索生物公司生產），二抗試劑盒、DAB 顯色試劑盒（福州邁新公司生產）[4]。

1.2.2 免疫組化方法 選取我院2016 年2 月至2018 年2月手術切除的食管癌標本，對新鮮食管鱗狀細胞癌切除標本進行固定（10% 中性福爾馬林），采用常規石蠟對組織進行包埋，對組織進行連續切片（4μm 厚），常規對其進行烘烤、蠟脫水、抗原修復，后嚴格按照試劑盒說明書對食管鱗狀細胞癌組織中的HIF-1α、CTSD 表達情況進行檢測，將已知陽性切片作為參考，PBS 代替一抗作為陰性對照[5]。具體的免疫組化圖片見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖2 免疫組化組織中存在角化珠（標尺：4 倍）

圖3 免疫組化組織中存在血管生成擬態現象（標尺：20 倍）

圖4 免疫組化組織中存在胞漿內陽性表達（標尺：40 倍）

1.2.3 CD34、PAS 染色應用免疫組化法 對CD34 進行染色，并進行DAB 顯色。按照PAS 試劑盒說明書依次加入1 滴0.5% 的高碘酸，對其進行還原，時間為10min ；后應用水流對其進行沖洗10min，之后將切片放置到避光濕盒內，再加入1 滴Schiff 試劑，將其放到37℃溫箱中孵育20min。待組織變成紅色后使用蒸餾水對其進行沖洗20min，后加入1 滴Mayer 蘇木精染液對細胞核復染2min，再使用溫水對其返藍1min 后進行脫水、封固[6]。

1.2.4 結果分析免疫組化染色后CTSD 陽性信號主要存在于細胞質，HIF-1α 陽性信號主要存在于細胞核[7]。按照陽性染色強度判斷標準對其進行評估：0 分：陰性；1 分：淡黃色；2 分：深黃色；3 分：棕色。按照陽性細胞 數 評 估：0 分：≤10%；1 分：11% ～30% ；2 分：31% ～69%；3 分：≥70%。陽性：兩項乘積≥3 分；陰性：兩項乘積＜3 分[8]。具體見圖5、圖6。

圖5 HIF-1α 在食管鱗癌組織中陽性表達于細胞核

圖6 HIF-1α 在食管鱗癌組織中陽性表達于細胞質

1.2.5 CD34、PAS 染色判斷標準 通過顯微鏡觀察，食管鱗狀細胞無內皮細胞，有腫瘤細胞圍成管腔；腔內有無紅細胞；PAS 全部或者是部分陽性；食管鱗狀細胞癌：免疫組化CD34 陰性[9]。判斷時由三位經驗豐富、高年資的醫生進行盲法讀片。

1.3 觀察指標

1）分析患者的HIF-1α、CTSD 表達情況與食管鱗狀細胞癌臨床特征情況。2）分析患者食管鱗狀細胞癌中CTSD 與血管生成擬態的相關性。3）分析患者食管鱗狀細胞癌中CTSD 與HIF-1α 的相關性。

1.4 統計學方法

數據應用SPSS18.0 進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α、CTSD 表達情況與食管鱗狀細胞癌臨床特征情況分析

130 例食管鱗狀細胞癌患者中，HIF-1α 陽性57 例，CTSD 陽性66 例；HIF-1α、CTSD 陽性表達情況與年齡、性別無明顯關系（P=0.071），但是HIF-1α、CTSD 陽性表達情況與脈管癌栓、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、浸潤程度明顯有關（P=0.023）。見表1。

表1 HIF-1α、CTSD 表達情況與食管鱗狀細胞癌臨床特征情況分析[例(%)]

2.2 食管鱗狀細胞癌中CTSD 與血管生成擬態的相關性分析

130 例患者中存在血管生成擬態患者的CTSD 陽性率高于無血管生成擬態患者，CTSD 與血管生成擬態呈正相關（P=0.017），見表2。

表2 食管鱗狀細胞癌中CTSD 與血管生成擬態的相關性分析

2.3 食管鱗狀細胞癌中CTSD 與HIF-1α 的相關性分析

130 例患者中HIF-1α 陽性患者的CTSD 陽性率高于HIF-1α 陰性患者，CTSD 與HIF-1α 呈正相關（P=0.022），見表3。

表3 食管鱗狀細胞癌中CTSD 與HIF-1α 的相關性分析

3 討論

食管鱗狀細胞癌是臨床消化科常見的惡性腫瘤。該腫瘤容易發生局部轉移、浸潤，且臨床致死率極高，而在腫瘤發生轉移與浸潤期間，血管生成發揮了重要的作用[10]。血管生成擬態是一種腫瘤細胞供血模式，它不需要依賴內皮細胞進行供血[11]。血管生成擬態的形成與腫瘤惡性程度有很大的關系。腫瘤生長速度越快，惡化程度就越高。腫瘤的侵襲能力越強，越容易形成血管生成擬態，臨床上可以將血管生成擬態作為判斷腫瘤患者預后不良的重要指標[12]。

惡性腫瘤血管生成擬態形成期間，除腫瘤自身發生形變外，細胞外基質降解重塑也是重要的一部分。因此，臨床上一般認為血管生成擬態形成與HIF-1α 誘導VEGF 表達，然后通過各級信號對級聯反應進行激活有關，最終會使細胞外基質發生降解，從而使得腫瘤細胞游離并形成了血管生成擬態。缺氧是惡性腫瘤中比較常見的微環境，在惡性腫瘤發生發展期間，缺氧導致CTSD 水平明顯升高。另外，CTSD 會參與細胞外基質降解，發揮重塑作用。本研究顯示，130 例食管鱗狀細胞癌患者中，HIF-1α 陽性57 例，CTSD 陽性66 例；HIF-1α、CTSD 陽性表達情況與年齡、性別無明顯關系（P=0.071），但是HIF-1α、CTSD 陽性表達情況與脈管癌栓、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、浸潤程度明顯有關（P=0.023）。這說明，HIF-1α、CTSD 參與了食管鱗狀細胞癌的浸潤與轉移。缺氧狀態在實體腫瘤環境中屬于基本狀態，腫瘤對微環境缺氧有適應與調節功效，而這種調節機制需要依賴于HIF-1α 因子的介導來完成，在這個過程中涉及侵襲轉移、細胞生存、血管生成[13-14]。在食管鱗癌中HIF-1α 因子的水平較高，且與腫瘤分期、轉移、血管生成擬態有很大的關系。相關研究發現，食管鱗癌中HIF-1α 因子的表達是判斷患者預后的重要指標。有研究顯示，血管生成擬態與HIF-1α因子的表達呈正相關，且與腫瘤的分期、淋巴結轉移有很大的關系，這可能與腫瘤惡性程度高、瘤細胞生長繁殖速度較快、變形能力較強、對周圍組織產生壓力、瘤組織內的間質液體量顯著升高有關。同時，腫瘤處于缺氧狀態會誘導HIF-1α 因子水平升高，HIF-1α 會通過調節多種血管生成因子表達情況來刺激血管新生，其中發揮作用最大、特異度最高的因子為血管內皮生長因子。當新生的血管無法滿足生長繁殖需要時，部分腫瘤細胞就會分泌大量細胞外基質來促使基質重塑，模擬血管結構使其與正常的血管相通，從而促進了血管生成擬態的形成，最終為腫瘤自身的生長提供了血氧。HIF-1α 因子水平升高會促使血管生成擬態的形成。本研究顯示，130 例患者中存在血管生成擬態患者的CTSD 陽性率高于無血管生成擬態患者，CTSD 與血管生成擬態呈正相關（P=0.017）；130 例患者中HIF-1α 陽性患者的CTSD 陽性率高于HIF-1α 陰性患者，CTSD 與HIF-1α 呈正相關（P=0.022）。這說明，腫瘤的惡性程度越高，腫瘤的繁殖生長速度就越快，且瘤體不斷增大會對周圍組織造成壓迫，使腫瘤出現缺氧狀態，使HIF-1α 水平顯著提高，而HIF-1α 水平與CTSD 呈正相關，HIF-1α 水平越高，CTSD 水平就越高。HIF-1α 會通過調節多種血管生成因子來刺激心血管的生成，整個過程為后期血管生成擬態的形成都奠定了基礎[15]。因此，血管生成擬態的形成與HIF-1α、CTSD 緊密相關。

綜上所述，對食管鱗狀細胞癌中HIF-1α、CTSD表達和血管生成擬態的關系進行研究發現，CTSD 表達與血管生成擬態存在一定的聯系，而HIF-1α 與CTSD表達存在一定的聯系。