S-三甲基-L-半胱氨酸對膀胱尿路上皮癌細胞Eg5基因表達和凋亡的影響

曹正國，田 超，鐘蘇權，周琳雄，陳桂柳

（汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院泌尿外二科，廣東 韶關 512026）

膀胱尿路上皮癌是泌尿外科發(fā)病率最高的惡性上皮腫瘤，目前臨床治療以手術為主，但手術后容易復發(fā)和轉移，對術后患者的預后、療效及能否獲得較好的生存預期有著重要的影響[1-2]。國內外較多的研究證實，膀胱尿路上皮癌是一種多基因腫瘤疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個復雜、多步驟的過程，包括基因組不穩(wěn)定性、原癌基因激活和抑癌基因失活、端粒酶的缺失等[3-4]。因此，在高轉移潛能的膀胱腫瘤細胞上尋找一些具有能識別復發(fā)和進展風險的獨特分子標志，可作為較敏感的標志物用于臨床預后的評估和靶向治療。細胞有絲分裂經(jīng)歷 G1期、S 期、G2 期和M 期，通過紡錘體的形成和運動，將復制染色體精確分配到兩個子代細胞中，此過程需要紡錘體、多種微管相關蛋白和有絲分裂檢查點蛋白的共同參與。有絲分裂紡錘體作為調控細胞有絲分裂活動的核心調控機制，是由驅動蛋白等多種功能蛋白質分子組裝和維護的，這些蛋白質分子目前已成為抗腫瘤細胞增殖的有效靶標[5-6]。紡錘體驅動蛋白Eg5 是驅動蛋白家族成員之一，抑制Eg5 能引起細胞周期停滯進而導致細胞凋亡。既往的驅動蛋白抑制劑不僅對有絲分裂細胞的微管有親和力，對軸突微管同樣產生作用，長期使用此類藥物會產生不可逆轉的神經(jīng)系統(tǒng)毒性、中性粒細胞減少癥等諸多毒副作用，而S-三甲基-L-半胱氨酸（STLC）是2004 年新發(fā)現(xiàn)的有效抑制Eg5 的靶向藥物[7-8]。目前有關Eg5 在膀胱腫瘤中作用的研究報道較少。為了研究STLC 抑制膀胱腫瘤與Eg5 的關系及靶向藥物治療的機制，我們分別采用流式細胞術、四甲基偶氮唑鹽微量酶反應（MTT）比色法、TUNEL 染色法、逆轉錄- 聚合酶鏈反應（RT-PCR）和Western Blotting 法檢測STLC 對體外培養(yǎng)的人膀胱尿路上皮癌BIU-87 細胞中Eg5 表達的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

STLC（164739，Sigma 公司）；人膀胱尿路上皮癌BIU-87 細胞（武漢大學典型培養(yǎng)物寶藏中心）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（475989-1GM，Sigma 公司）；TUNEL試劑盒（C1098，碧云天生物有限公司）；Trizol 試劑（15596018，Gibcol 公司）；RT-PCR 試劑盒（KR123，TIANGEN 公司）；兔抗人Eg5 多克隆抗體（SC-365593，Santa Cruz 公司）；Western Blotting system 和ECL 發(fā)光試劑盒（RPN2236，Amersham 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)貼壁到對數(shù)生長期的BIU-87細胞以臺盼藍染色實驗檢測，當細胞活力達到95% 以上時，用無血清1640 培養(yǎng)液洗滌2 次，每孔滴加含5 μmol/L的STLC 共孵育再繼續(xù)培養(yǎng)，觀察時間點分別選取0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 和24 h。

1.2.2 細胞周期阻滯的檢測 收集上述不同時間段經(jīng)STLC 處理的細胞，進行PI 染色，以流式細胞術對上述細胞進行細胞周期阻滯的檢測和早期凋亡（亞二倍體峰）誘導分析。

1.2.3 細胞周期阻滯后可逆性恢復的檢測 經(jīng)STLC 與BIU-87 共孵育18 h 后，應用PBS 緩沖液輕輕沖洗細胞兩次，去除STLC 藥物后以1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在不同時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 等）收集上述細胞，碘化丙啶染料染色后，以流式細胞術對上述細胞再次行細胞周期阻滯的檢測和早期凋亡誘導分析。

1.2.4 MTT 比色法檢測細胞增殖抑制率 收集STLC 共孵育24 h 的細胞（以下均同），并調節(jié)細胞濃度至1×104個/mL，接種在96 孔培養(yǎng)皿上，設空白對照組。每組細胞加入20 μL 的MTT 溶液，4 h 后加入100 μL 的二甲基亞砜，充分混勻，搖床低速震蕩15 min，采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度，計算細胞增殖抑制率，計算公式：細胞增殖抑制率=（A 空白對照組-A 實驗組）/ A 空白對照組×100%。

1.2.5 TUNEL 染色實驗檢測細胞凋亡 在玻片上制備細胞爬片，加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30 min，按照TUNEL 試劑盒說明書進行凋亡程序檢測，并設置陰性對照，在放大倍數(shù)（×400）鏡下可見棕褐色顆粒狀著色的BIU-87 細胞核即為凋亡細胞，統(tǒng)計500 個細胞中凋亡細胞所占的百分比，即為凋亡指數(shù)。

1.2.6 RT-PCR 法 檢 測Eg5 mRNA 的 相 對 表 達細胞總RNA 的提取參照Trizol 試劑使用說明書進行。 通過Primer 5.0 引物設計軟件設定Eg5 引物：上 游5’-ATTTGGCGGCTCCGACTGGC -3’、 下 游5’-TGGGCGCTAGCTTTCCGCTC -3’ 和 內 參 基 因β-actin 引物：上游 5 ’- GACTGCCTGCCTCACTTT-3 ’、下 游 5’-GCTGATCTCGGCTTCTGT-3’。RNA 逆 轉 錄獲取DNA 后，以兩步法進行RT-PCR，將5 μL 體積的PCR 產物在1.5% 瓊脂糖凝膠上進行電泳，將電泳條帶在蛋白轉膜儀凝膠成像系統(tǒng)中進行分析，通過Quantity One 軟件計算灰度值，計算Eg5 與β-actin 的比值。

1.2.7 Western Blotting 法檢測Eg5 蛋白的表達 以5:1比例將組織蛋白裂解液與細胞混勻，離心后取10 μL 上清液并以1:1 比例與上樣緩沖液放入沸水中水浴、離心，再取上清液。將50 μg 總蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 恒壓電泳2 h，將電轉化的蛋白轉移至PVDF 膜，加入膜封閉液充分覆蓋，室溫振蕩封閉2 h 后加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗孵育PVDF 膜2 h，洗膜3 次，按照ECL和Western Blotting system 試劑盒方法進行顯色，于掃膜儀下曝光、顯影，計算光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0 對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 STLC 誘導BIU-87 細胞周期阻滯和凋亡的情況

將STLC 與BIU-87 細胞共孵育，不同時間點收集細胞，可見隨著STLC 作用時間延長至16 h，細胞有絲分裂周期中G2/M 期的BIU-87 細胞明顯增多（29.6%），且細胞發(fā)生凋亡的比例也有明顯增加的趨勢。統(tǒng)計分析顯示，與0 h 相比，STLC 處理16 h 時細胞凋亡比例升高，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.409，P=0.020）。以上結果表明，STLC 在阻滯BIU-87 細胞周期進程的同時，可誘導其細胞發(fā)生凋亡。詳見圖1。

圖1 STLC 在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h 等不同時間對BIU-87 細胞周期和凋亡的影響

2.2 STLC 去除后對細胞有絲分裂周期的恢復及凋亡的影響

去除STLC 后再培養(yǎng)，于不同時間點收集細胞，結果表明STLC 去除后BIU-87 細胞周期進程開始恢復，與去除1 h 時G2/M 期細胞比例（34.84%）相比，去除3 h后G2/M 期細胞比例（24.9%）顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.590，P=0.001）；細胞凋亡比例差異也有統(tǒng)計學意義（χ2=3.879，P=0.049）。詳見圖2。

圖2 去除藥物作用后在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 等不同時間對BIU-87 細胞周期和凋亡的影響

2.3 STLC 對細胞的生長增殖抑制作用、凋亡及Eg5 mRNA 和蛋白表達的影響

從下表1 可見，與對照組相比，STLC 處理組細胞增殖抑制率和凋亡指數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與對照組相比，STLC 處理組Eg5 mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。以上結果表明，STLC 可明顯抑制BIU-87 細胞生長及誘導其凋亡，并顯著降低Eg5 mRNA 和蛋白的表達水平。

表1 兩組BIU-87 細胞生長抑制率、凋亡指數(shù)及Eg5 相對表達水平的對比（± s ）

表1 兩組BIU-87 細胞生長抑制率、凋亡指數(shù)及Eg5 相對表達水平的對比（± s ）

組別 細胞增殖抑制率 凋亡指數(shù) Eg5 mRNA 相對表達 Eg5 蛋白相對表達空白對照組 1.92±0.17 3.94±0.46 1.32±0.21 1.07±0.09 STLC 處理組 16.58±4.23 19.25±4.46 0.57±0.05 0.46±0.07 t 值 77.433 76.353 77.688 119.631 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是各復雜病因學機制和多基因組參與、多階段形成的動態(tài)過程，包括腫瘤細胞的增殖、黏附、血管形成和侵襲、轉移等復雜環(huán)節(jié)。在此過程中，腫瘤細胞生長因子信號通路的持續(xù)激活狀態(tài)，能使腫瘤細胞具有無限增殖的能力，進而導致細胞增殖不受機體調控及形成大量非整倍體細胞，因此抑制腫瘤細胞增殖成為腫瘤治療的基本策略之一。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)人膀胱尿路上皮癌腫瘤干細胞的增殖性較強，同時其自我更新能力也較強[9]。近年來，隨著對腫瘤干細胞研究的不斷深入，人們逐漸認識到腫瘤細胞具有異質性，并非所有腫瘤細胞的生物學行為都相同，只有少部分腫瘤細胞具有廣泛增殖、能形成腫瘤或引起腫瘤轉移的能力。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，細胞有絲分裂中的紡錘體在細胞增殖中起著重要作用[10-11]。驅動蛋白Eg5 位于人染色體10q24.1，在有絲分裂前中期推動雙極紡錘體分離的過程中起關鍵作用，其過度表達會導致紡錘體缺失、遺傳不穩(wěn)定、細胞分裂異常和基因組不穩(wěn)定，從而導致腫瘤的發(fā)生[12]。Castillo 等[13]在利用基因敲除技術研究轉基小鼠的過程中發(fā)現(xiàn)，Eg5 表達較高會干擾紡錘體組裝并造成其功能紊亂，引起雙極紡錘體的分離缺失及基因組的不穩(wěn)定性增加，導致腫瘤發(fā)生。驅動蛋白Eg5 參與了細胞有絲分裂的關鍵環(huán)節(jié)，人體成熟組織細胞中存在微量Eg5 的表達，但很多惡性腫瘤組織中Eg5 均存在異常過度表達，目前Eg5 已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵基因和重要的治療靶點。研究還發(fā)現(xiàn)，高表達Eg5 的乳腺癌患者往往預后不良，其機制在于內源性Eg5 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路從而增強了乳腺癌干細胞的生物學功能和自我更新能力[14]。盧正磊等[15]研究也發(fā)現(xiàn)伴有門脈癌栓的肝癌組織Eg5 的表達率高達75%，特別是在較高的TNM 分期、病理分級和伴有門脈轉移時Eg5的表達率會更高；而Eg5 mRNA 的表達則與肝癌患者的性別差異、年齡大小、腫瘤包膜完整與否等均無顯著相關性。以上研究均表明Eg5 作為一個腫瘤侵襲、進展的重要獨立預測標志物，既可作為膀胱腫瘤的預后標志物，也可作為藥物治療的靶點和療效評估指標。通過抑制Eg5的表達能夠引起細胞周期的停滯，最終可導致細胞凋亡，但不會對微管參與的其他生物過程造成破壞。這與傳統(tǒng)作用于微管的藥物不同，不會影響微管的穩(wěn)定性，也不會產生神經(jīng)毒性，因此，現(xiàn)階段驅動蛋白Eg5 已成為腫瘤化療藥物新的作用靶點，備受藥學界的關注。2004 年STLC 被學者測量出分子式為C22H21NO2S，分子量為363.5，且結構簡單、易合成、價格低廉。隨后DeBonis等[7]通過微管激活三磷酸腺苷（ATP）酶活性抑制實驗首次證明STLC 能特異地結合腫瘤細胞高表達的Eg5 蛋白分子，誘導Eg5 產生變構效應而喪失功能，導致紡錘體極向運動受阻、雙極紡錘體不能正確形成，從而出現(xiàn)大量單星狀紡錘體細胞，阻滯細胞的有絲分裂進程并引起細胞凋亡，是Eg5 蛋白有效的靶向抑制劑，具有高度的特異性、有效性和安全性，且高濃度的STLC 對處于分裂間期的細胞沒有毒副作用，顯示出較強的抗腫瘤活性，極有臨床開發(fā)和應用價值。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)STLC 能阻斷Ph 染色體陽性的白血病細胞G2/M 的細胞周期進程，并導致白血病細胞凋亡，提示STLC 在惡性血液病中具有重要的潛在治療價值[16]。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)STLC 可抑制膀胱尿路上皮癌BIU-87 細胞的增殖，并能阻滯BIU-87 細胞的有絲分裂進程及誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖，且這種細胞程序性凋亡的發(fā)生與藥物作用時間呈密切正相關，這可能是STLC 治療膀胱癌的具體機制。此外，在本研究中，我們根據(jù)RT-PCR和Western Blotting 實驗結果發(fā)現(xiàn)，STLC 能顯著抑制膀胱尿路上皮癌BIU-87 細胞中Eg5 的表達。根據(jù)以上研究結果，我們猜測STLC 可能通過抑制BIU-87 細胞中Eg5的表達，進而進一步阻滯細胞有絲分裂周期進程、抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的發(fā)生。以上研究結果再次驗證了STLC 在抑制膀胱癌細胞的生長和發(fā)展過程中起到的重要作用，同時也為STLC 在膀胱腫瘤的治療中提供了新的實驗數(shù)據(jù)和初步理論基礎。Kozielski 等[17]研究顯示，STLC 處理HeLa 細胞24 h 后可見Caspase9 表達水平隨藥物劑量的增加而升高，Caspase8 的升高則發(fā)生在給藥后48 h ；而凋亡效應分子Caspases3 和PARP1 僅見微弱升高，表明STLC 通過激活紡錘體組裝檢查點蛋白BubR1、細胞周期素B 以及促進極光激酶A 表達增高而致細胞凋亡，提示STLC 可通過傳統(tǒng)的線粒體途徑介導細胞凋亡，同時還可能通過Caspase 非依賴途徑介導細胞凋亡。

通過對本研究內容的總結和思考，有必要對STLC下調膀胱腫瘤Eg5 表達和抑癌的分子機制進行下一步的探索，這將有助于我們闡明膀胱癌有關細胞有絲分裂過程的發(fā)生機制，對臨床腫瘤預后的判斷、抗腫瘤靶點的選擇及研發(fā)相關的靶向藥物提供新的依據(jù)和理論基礎，而這都需要在以后更多的研究中得到印證。此外，STLC在不同人膀胱癌中的作用是否存在差異還需要進一步研究證實。