蒙古冰草ERF轉錄因子生物信息學及其表達分析

吳 婧，范菠菠，張學峰，宋金微, 房永雨，于 卓，閆秀秀，趙 彥，馬艷紅*

(1.內蒙古農業大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.內蒙古農業大學草原與資源環境學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

轉錄因子(Transcription Factors，TFs)在植物中是一種最重要的一類調節基因，可與真核生物基因的啟動子區域中順式作用元件發生特異性結合的DNA結合蛋白，通過與其他蛋白相互作用，激活或抑制基因轉錄[1]。根據DNA結構域的特點，將轉錄因子分為若干個家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，BZIP，其中AP2/EREBP是植物中分布廣泛的一類轉錄因子[2]。根據AP2/EREBP轉錄因子保守結構域的不同，AP2/ERFBP家族被進一步分為AP2，RAV，DREB，ERF和Soloist五個亞族[3]。ERF是AP2/ERFBP家族中最大的一類亞族[4]。ERF轉錄因子參與植物多種生物學過程，與非生物脅迫密切相關，如干旱[5-6]、低溫[7]、高鹽[8]、病害[9]。ERF轉錄因子通過參與乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號轉導途徑，調控下游基因的表達，從而綜合提高植物的抗逆性[10]。到目前為止，在PlantTFDB數據庫中，共收錄了166種作物的ERF轉錄因子，共有21 129個。

干旱是限制植物生長的重要因素，會誘導植物發生滲透失衡等不良反應，妨礙植物各階段的生長發育和代謝，進而影響農作物的產量[11]。大量研究表明，ERF轉錄因子參與干旱脅迫，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)DREB2A基因的表達受脫水誘導引起植株矮化[12]。大豆(Glycinemax)在模擬干旱條件下，轉基因煙草GmERF3[13]過表達，導致游離脯氨酸含量多于野生型煙草，可提高煙草的抗旱性，大豆GmERFb對干旱產生響應[14]。小麥野生近緣植物纖毛鵝觀草(Roegneriaciliaris(Trin.)Nevski)中的RcDREB1基因對干旱、高鹽和重金屬非生物脅迫產生應答[15]。小麥(Triticumaestivum)TaERF1在干旱脅迫和外源ABA、乙烯和水楊酸的誘導條件下，TaERF1過表達可激活與逆境相關的基因[16]。粳稻(Oryzasativa)中第Ⅶ亞族的ERF轉錄因子OsLG3通過誘導活性氧可提高旱稻的抗旱能力[17]，OsERF3基因其含有EAR抑制結構域基序，對干旱脅迫起負調控作用[18]。

蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)原名沙蘆草，抗逆性強，是優質的多年生二倍體禾本科牧草[19]。迄今，體內的多種抗逆基因尚未被發現，作為小麥族牧草，研究蒙古冰草的抗逆基因對牧草及麥類的遺傳改良具有重要意義。ERF參與植物生長和逆境脅迫響應，但蒙古冰草ERF轉錄因子的研究尚屬空白。本研究基于干旱脅迫下蒙古冰草的RNA-Seq，旨在篩選可能與抗旱相關的ERF轉錄因子，為下一步開展蒙古冰草抗旱基因功能解析奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

本試驗材料為蒙古冰草(A.mongolicumKeng)，種子采自于內蒙古農業大學薩拉齊牧草繁種基地。挑選顆粒飽滿的種子于室內培養箱(BIC-300)水培生長，溫度為(24±1)℃、光周期為16 h，在三葉一心時期用含25%的PEG-6000的1/5 Hoagland’s營養液進行模擬干旱處理，同時設置對照處理(CK)，之后在干旱12 h，24 h，48 h，3 d，5 d，7 d及復水24 h取樣，每個處理時期3次重復，提取total RNA，委托杭州聯川生物技術股份有限公司進行轉錄組測序[20]。

1.2 蒙古冰草ERF轉錄因子篩選

從干旱脅迫下蒙古冰草轉錄組測序數據中(NCBI Bioproject accession number PRJNA742257，SRA accession number SUB9924544 and SUB9990857)，根據功能注釋初步篩選出41個ERF轉錄因子，利用notepad++軟件找到核苷酸序列，用NCBI中的ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)閱讀框將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，使用PlantTFDB中的Prediction(http://planttfdb.gao-lab.org/prediction.php)進行分析，篩選出具有ERF結構域的氨基酸序列，然后用該網站中的BLAST(http://planttfdb.gao-lab.org/blast.php)與所有的物種進行同源比對，除去與其他物種無同源性的ERF蛋白序列。

1.3 蒙古冰草ERF轉錄因子理化性質分析及亞細胞結構定位

利用在線分析軟件Expasy中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)[21]對篩選出的蒙古冰草ERF轉錄因子的氨基酸數目、相對分子質量、PI值、脂肪指數、親疏水性的理化性質進行分析；用Cell-PLOC 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)[22]對蒙古冰草ERF轉錄因子進行亞細胞結構定位預測。

1.4 蒙古冰草ERF轉錄因子保守基序及序列比對

用在線分析軟件The MEME Suite中的MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)[23]對篩選出來的蒙古冰草ERF轉錄因子的保守基序進行分析；使用DNAMAN軟件進行多序列比對，然后用WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)[24]對蒙古冰草ERF保守結構域進行預測。

1.5 蒙古冰草ERF進化關系分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫、PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)的ERF數據庫，篩選出具有抗旱功能的13條擬南芥(Arabidopsisthaliana)、6條山羊草(Aegilopstauschii)、9條二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、4條大麥(Humuluslupulus)、5條秈稻(Oryzasativasubsp.indica)、8條粳稻(Oryzasativasubsp.japonica)、4條小麥(Triticumaestivum)的ERF氨基酸序列，并與蒙古冰草的ERF轉錄因子的氨基酸序列用MEGA7.0[25]的Muscle進行多序列比對，用相鄰連接法(neighbor-joining)構建系統進化樹。設置校驗參數Boostrap為1000，其他參數均設為默認值。用EvolView(https://evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees/1/2)[26]將進化樹進行美化。

表1 已報道抗旱相關ERF轉錄因子

1.6 蒙古冰草ERF轉錄因子二、三級結構預測

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_ sopma.html)對蒙古冰草ERF轉錄因子二級結構預測分析，并用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線軟件的同源建模法對其三級結構進行預測分析。

1.7 不同干旱處理蒙古冰草ERF轉錄因子基因差異表達分析

蒙古冰草轉錄組數據庫使用TPM(Transcripts per million)對樣本表達量進行歸一化處理，利用DESeq2軟件分析不同處理間的差異基因。用軟件Heml對蒙古冰草ERF轉錄因子的共表達模塊與性狀矩陣進行關聯分析，并用Color Dialog對其進行顏色處理，分析其在不同干旱處理下的差異表達情況。

1.8 蒙古冰草ERF轉錄因子qRT-PCR

使用primer premier 5將篩選出的可能具有抗旱功能的蒙古冰草ERF轉錄因子(AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1,AmERF4-2)進行引物設計，以U6作為內參基因，(引物序列見表2)，然后將引物委托上海生工(Sangon，上海)進行序列合成。

表2 蒙古冰草抗旱相關ERF基因qRT-PCR引物序列

使用Trizol法提取蒙古冰草CK，干旱處理1 d,3 d,5 d,7 d及復水24 h的總RNA，使用FastKing RT Kit(with gDNase)試劑盒將蒙古冰草處理組及對照組的Total RNA反轉錄為cDNA，用MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑盒(MQ10201S)進行qRT-PCR試驗，每個處理4次生物學重復。qRT-PCR總反應體系為20.0 μL，其中上下游引物(10 μM)各0.4 μL,cDNA模板1.2 μL,Nuclease-Free Water 8 μL,MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑10 μL。反應程序為預變性95℃,30 s，變性95℃,10 s，退火61℃,10 s，延伸72℃,30 s，循環數為40，在FTC-3000P上運行程序。按照2-ΔΔCT法[35]計算基因的相對表達量，并使用SPSS 26.0軟件對其差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蒙古冰草ERF基因篩選

從蒙古冰草轉錄組數據庫中的41 793條Unigenes中篩選出41個ERF基因，通過ORF和結構域預測分析，獲得具有ERF結構域的25個基因。BLAST序列比對發現，有18個與其他物種具有親緣關系，其中DN17657_c2_g1,DN22794_c0_g6,DN22189_c0_g1與山羊草(Aegilopstauschii)親緣關系最近，相似度在66%～84%之間；DN20439_c0_g14,DN22390_c0_g1,DN25557_c0_g6,DN23100_c2_g10,DN22189_c1_g2,DN19595_c1_g1與小麥(Triticumaestivum)親緣關系最近，相似度在61%～78%；DN26859_c0_g2,DN25557_c0_g4,DN25557_c0_g1,DN26859_c0_g7,DN22794_c0_g2與大麥(Hordeumvulgare)親緣關系最近，相似度在55%～70%之間；DN19955_c0_g1與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)親緣關系最近，相似度為50%；DN26921_c0_g2與擬南芥(Arabidopsisthaliana)親緣關系最近，相似度為79%，表明從蒙古冰草的ERF轉錄因子基因結構具有保守性，與山羊草(A.tauschii)、小麥(T.aestivum)、大麥(H.vulgare)同源性較高。

2.2 蒙古冰草ERF轉錄因子理化性質及亞細胞定位分析

18個蒙古冰草的ERF轉錄因子氨基酸數目在70 aa～404 aa之間，相對分子質量介于7 447.54～43 654.9之間；理論等電點(PI)在4.53～11.10之間，有11個ERF轉錄因子理論等電點小于7、呈現酸性，有7個ERF轉錄因子大于7、呈現堿性；脂肪族指數最小為47.61，最大為75.71；有16個ERF轉錄因子總平均親水性小于0，為親水性蛋白，僅有兩個總平均親水性大于零，為疏水性蛋白(表3)。

蒙古冰草ERF轉錄因子基因亞細胞定位分析，有13個ERF轉錄因子定位在細胞核中，AmERF071,AmERF014定位在細胞質中，AmERF008存在于細胞核和細胞質中，AmERF3-2定位在細胞膜上，AmERF110-2定位在細胞外，表明ERF轉錄因子基因主要在細胞核中發揮功能(表3)，少數在細胞質、細胞膜、細胞外發揮功能。

表3 蒙古冰草ERF轉錄因子理化性質及亞細胞定位

2.3 蒙古冰草ERF轉錄因子基序分析

蒙古冰草ERF轉錄因子保守基序分析發現7種motif(圖1)，有16個ERF轉錄因子氨基酸序列出現保守的motif，AmERF061-1和AmERF110-2轉錄因子不含有motif。在含有motif的序列中，有15個ERF轉錄因子含有motif2、14個ERF轉錄因子含有motif1、13個ERF轉錄因子含有motif3、6個ERF轉錄因子含有motif6、2個ERF轉錄因子含有motif7、2個ERF轉錄因子含有motif5，同時含有基序motif1，motif2，motif3的序列有12個，出現的次數最多。motif1特征基序的(x)GRR(x)EI、motif2基序(x)RWLG(x)AA(x)D和motif3基序(x)G(x)N(x)構成AP2的結構域特征序列，且motif1,motif2,motif3通常以串聯形式在一起，所以推測motif1,motif2,motif3基序為蒙古冰草ERF轉錄因子的保守基序(圖2)。

圖1 蒙古冰草ERF轉錄因子基序分析

圖2 蒙古冰草ERF轉錄因子的保守基序

通過DNAMAN軟件對18個蒙古冰草ERF基因編碼的氨基酸序列進行多序列比對，發現AmERF061-1,AmERF061-2,AmERF1,AmERF014,AmERF110-2不具有AP2結構域，AmERF061-1和AmERF061-2氨基酸序列發生變化，AmERF1的C端發生缺失，AmERF014的N端發生缺失，AmERF110-2的N端發生變化、而C端發生缺失(圖3)。用WebLogo3分析18個蒙古冰草ERF轉錄因子的保守性，其存在AP2結構域特征序列(x)GRR(x)EI(x)RWLG(x)AA(x)D(x)G(x)N(x)，在第二個β-折疊中第14位氨基酸是丙氨酸(A)，19位是天冬氨酸(D)(圖3,圖4)。

圖3 蒙古冰草ERF家族基因的氨基酸序列比對

圖4 蒙古冰草ERF轉錄因子家族的保守結構域

2.4 蒙古冰草ERF轉錄因子進化關系分析

本研究將蒙古冰草ERF與玉米(Zeamays)ZmDREB160，大豆GmERF4,GmERF6，馬鈴薯(Solanumtuberosum)StERF1，小麥TaERF1等具有抗旱功能的轉錄因子構建進化樹，結果將ERF轉錄因子劃分為10個亞族，其中有5個亞族不含有蒙古冰草ERF轉錄因子。第Ⅰ亞族和第Ⅴ亞族分別有1個ERF轉錄因子，AmERF008劃分在第Ⅰ亞族，AmERF014劃分在第Ⅴ亞族；第Ⅱ亞族中有3個ERF轉錄因子，分別是AmERF071,AmERF061-1,AmERF061-2,AmERF053和AmERF060兩個轉錄因子劃分在第Ⅵ亞族，其中AmERF053與擬南芥AT2G20880.1(AtERF53)聚為一個分支；第Ⅲ亞族是最大的亞族，共有10個蒙古冰草ERF轉錄因子在此亞族中，其中AmERF3-1，AmERF4-3,AmERF1聚在一個分支，AmERF3-2,AmERF114,AmERF110,AmERF109聚在一個分支上，AmERF4-1與大豆GmERF6、馬鈴薯StERF1、擬南芥AtERF9在一個小分支，AmERF4-2與大豆GmERF4聚在一個小分支，AmERF1B與擬南芥AtERF11在一個分支。根據MEGA分族及各族的成員推測蒙古冰草ERF轉錄因子的功能，StERF1,AtERF9,GmERF6,GmERF4,AtERF11,AtERF53這些轉錄因子均被證明與干旱脅迫相關，根據以上結果推測蒙古冰草AmERF4-1,AmERF4-2,AmERF1B,AmERF053也具有相似的功能，可能參與干旱脅迫響應。

2.5 蒙古冰草ERF基因不同干旱處理表達模式分析

蒙古冰草在干旱處理 12 h,24 h,48 h,3 d,5 d,7 d、復水 24 h及對照(CK)情況下，其中15個ERF基因表達量呈顯著差異表達(圖6)。基因表達量的大小與數值有關，數值越大表達量越大，表達量越大越接近紅色，表達量越小越接近藍色。6個ERF基因表達量較高，其中AmERF3-1基因表達量最高。AmERF110和AmERF061-1兩個基因有表達，但是表達量較低在0～2之間，視為無效表達。隨著干旱處理時間延長，AmERF053,AmERF4-1,AmERF3-1,AmERF3-2,AmERF109和AmERF114共6個基因表達量呈現上調趨勢，AmERF1B,AmERF071,AmERF110-2,AmERF060共4個基因的表達量隨著干旱處理的進程呈現先升高后降低的趨勢，復水24h上調，隨著干旱處理的進程AmERF1基因表達量與CK相比較呈現先降低后升高的趨勢，AmERF4-2和AmERF061-2基因表達量隨著干旱處理過程中先升高后降低再升高。雖然都屬于ERF家族，但ERF轉錄因子在不同干旱處理下表達模式存在差異。

圖6 蒙古冰草ERF基因不同干旱表達模式

2.6 蒙古冰草抗旱相關的ERF轉錄因子二、三級結構

對蒙古冰草AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1和AmERF4-2轉錄因子進行二級結構預測，主要以無規則卷曲為主，分別占59.03%,51.85%,61.32%和51.05%，其次是α-螺旋，分別占26.65%,34.68%,22.22%和32.49%，延伸鏈分別占9.69%,9.43%,12.35%和10.97%，β-折疊分別占4.63%，4.04%,4.12%和5.49%，表明4個蒙古冰草抗旱相關的ERF轉錄因子的二級結構主要以無規則卷曲和α-螺旋為主。

根據SWISS-MODEL的同源建模法對AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1和AmERF4-2四個ERF轉錄因子的三級結構建模結果顯示(圖8)，4個ERF三級結構都與擬南芥的ERF轉錄因子相匹配，含有AP2結構域，符合ERF結構域特征，三級結構與二級結構相吻合，且有1個α-螺旋，3個β-折疊的空間結構。

圖7 蒙古冰草ERF轉錄因子二級結構預測

圖8 蒙古冰草ERF轉錄因子三級結構

2.7 蒙古冰草ERF基因的表達分析

對篩選出的與抗旱相關的蒙古冰草4個ERF基因進行RT-qPCR分析，4個ERF基因對干旱脅迫響應程度不同，AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1呈現上調表達；AmERF053和AmERF1B兩個基因在5 d表達量最高，AmERF4-1在3 d表達量最高；AmERF4-2各個處理組的表達量均低于CK，呈現下調表達。在0.05水平上，4個ERF基因的處理組表達量均與CK的表達量存在顯著性差異，說明蒙古冰草ERF家族基因參與蒙古冰草對干旱脅迫的響應。

圖9 干旱脅迫下蒙古冰草抗旱相關的ERF基因相對表達量

3 討論

為篩選蒙古冰草抗旱相關的ERF轉錄因子，本研究基于生物信息分析，篩選出25個具有ERF結構域的基因，通過BLAST序列比對發現，18個序列與其他物種具有親緣關系，7個序列與其他物種無親緣關系，總共篩選出16個具有AP2保守結構域的ERF轉錄因子。ERFs一般含有1個AP2保守結構域，AP2結構域由60～70個氨基酸殘基組成[36]，蒙古冰草ERF的AP2結構域N端含有3個β-折疊片段，C端有1個α-螺旋片段，在N端含有YRG保守元件，呈堿性，C端含RAYD保守元件，這可能與其他蛋白互作有關[37]，蒙古冰草ERF的AP2序列與大豆[38]、油橄欖(Oleaeuropaea)[39]ERF家族氨基酸序列一致。在同一基因家族中，擁有共同的保守基序可能發揮相似的功能[40]。在蒙古冰草ERF轉錄因子保守基序分析中，共出現了7個motif，其中motif1,motif2和motif3出現次數最多，通常以串聯形式出現，是其共同含有的保守基序，motif1含有YRG保守原件，motif2含有RAYD保守原件，與桃、蘋果、擬南芥ERF轉錄因子家族具有相似的結構[41-43]。

通過對蒙古冰草ERF轉錄因子的理化性質分析發現大多數為親水性蛋白，與馬鈴薯StERF109的ERF蛋白親疏水性保持相似[44]。亞細胞定位表明蒙古冰草ERF轉錄因子大多數在細胞核中發揮功能，少數在細胞質和其他部位發揮功能，和木薯(Manihotesculenta)[45]、小麥[46]亞細胞定位情況相似。根據4個ERF蒙古冰草轉錄因子的二、三級結構的結果顯示，ERF主要以無規則卷曲為主，α-螺旋次之，與小黑楊(Populussimonii×P.nigra)ERF723[47]的二、三級結構相似，其三級結構有些差異，可能其所處亞族不同，這些差異與α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲的長度有關，這些差異會使其發揮不同的功能[48]。

ERF轉錄因子在植物生長發育和抵御外界脅迫發揮著不同的作用[49]。蒙古冰草ERF轉錄因子和具有抗旱功能的ERF轉錄因子進行系統進化關系分析，擬南芥AtERF9[33],AtERF11[34],AtERF53[32]與GCC box或下游基因啟動子的脫水反應元件結合，調控干旱應答基因的表達從而提高植株的抗旱能力。將大豆GmERF6[29]基因轉入到擬南芥中，經過斷水處理與野生型植株相比較，轉基因植株的種子發芽率高且正常生長、開花，在干旱脅迫下，GmERF4[28]在干旱處理后24 h內基因表達量顯著增加。StERF1在干旱處理后SDR(短鏈脫氫酶)、游離脯氨酸、丙二醛(MDA)等含量明顯增加，轉基因植株的株高、莖高、根長、鮮重等指標都高于未轉基因的植株，過量表達的StERF1可提高馬鈴薯的抗旱能力[30]。這些均被證明與干旱脅迫響應有關，且與蒙古冰草有較高的同源性，進而推測蒙古冰草AmERF4-1,AmERF4-2,AmERF1B,AmERF053也具有相似的功能，可能參與干旱脅迫響應。

經過qRT-PCR驗證4個蒙古冰草ERF基因處理組的表達量與CK組相比較存在顯著性差異，既有正向調控又有負向調控，AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1呈現上調表達，與趙夢雨研究結果一致，其通過qRT-PCR分析結果表明，苦蕎(Fagopyrumtataricum)FtDREB6轉錄因子在干旱脅迫下起正調控作用[50]，趙彥對蒙古冰草MwDREB3基因進行實時熒光定量RT-PCR，結果分析表明MwDREB3在干旱脅迫下表達量上調[51]。AmERF4-2呈現下調表達，目前，關于ERF基因下調表達的研究較少較少，從水稻中發現OsERF109基因通過抑制乙烯的釋放從而對水稻的抗旱性起負調控作用[52]。

4 結論

本研究基于蒙古冰草轉錄組測序數據篩選出41個ERF轉錄因子，其中18個具有ERF結構域特征，通過對其保守基序、保守結構域、進化關系及表達模式分析，獲得4個可能具有抗旱功能的蒙古冰草ERF轉錄因子，其二、三結構主要以無規則卷曲為主。對4個ERF基因進行差異表達分析，qRT-PCR結果分析表明AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1起正調控作用，AmERF4-2呈現負調控作用。