miR396-MsGRFs參與調控紫花苜蓿愈傷組織再生

陳筱冉，嚴建萍，仇如夢，劉燕蓉，張萬軍

(中國農業大學草業科學與技術學院，北京 100193)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是我國重要的豆科牧草，被譽為“飼料皇后”[1]，是我國廣泛栽培的優良牧草[2]，其具有異花授粉、同源四倍體、自交不親和等特性。這些特性使得我國紫花苜蓿育種手段一直停留在以群體選擇和雜交選育為主的傳統育種階段[3-5]。現有的高新育種技術手段如轉基因、基因編輯、分子設計育種等幾乎未進入牧草育種領域，而這些技術的實施都是基于高效的遺傳轉化體系。因此，轉化體系的缺乏或不成熟是限制牧草分子育種的“卡脖子”技術之一[5]。在遺傳轉化過程中，如何刺激轉基因細胞再生成完整可育的植株一直是植物育種者努力攻克的難題[6]。

紫花苜蓿不同基因型對愈傷組織體細胞胚的產生具有十分顯著的影響，有些研究者甚至認為其產生的影響可以使培養基的差異忽略不計[6]。研究發現，苜蓿的雜合程度和胚狀體及再生苗的形成呈正相關，并且再生率高的材料用不同方式培養均可獲得愈傷組織，其他基因型對形成愈傷及再生條件都更加嚴格[7-9]。因此，苜蓿及多數草類植物的研究開始趨向于探索特定品種的培養條件。這嚴重限制了苜蓿遺傳改良中種質資源的利用和育種進程。

近年來，研究者鑒定了一批參與體細胞胚胎發生及形態建成的基因，如生長調控因子(GROWTH-REGULATING FACTOR，GRF)轉錄因子家族基因[6]。在多種植物中研究發現，異位過表達參與分生組織維持、體細胞胚胎發生或植物激素代謝的基因可克服植物再生障礙，這為體細胞再生及遺傳轉化提供了有用的工具[6]。GRF家族為植物體內保守的轉錄因子家族，其編碼的蛋白含有的QLQ和WRC結構域，分別介導蛋白質-蛋白質和蛋白質-DNA的相互作用[10-12]。許多被子植物和裸子植物的GRF攜帶microRNA396(miR396)的靶位點，受miR396轉錄后剪切調控[13]。目前研究認為，miR396-GRF通路是調控植物器官大小的重要途徑。其主要通過促進細胞增殖和生長，從而調控各器官的生長發育，如葉片擴張、莖和根的伸長、種子和花的形成等[14-15]。另外，植物體內GRF蛋白與GIF輔助因子形成復合物，這些復合物在體內也與染色質重塑復合物相互作用[16-17]。近年來研究發現，過表達小麥GRF4-GIF1嵌合體的轉基因植物均表現出正常的表型，其再生效率較空載體對照高7.8倍[18]。GRF5的異位表達，在促進各種作物物種的再生和遺傳轉化中有積極的作用[19]。而紫花苜蓿miR396-GRF通路基因信息及其對苜蓿再生的影響尚未見報道。

本研究中，我們鑒定了紫花苜蓿中含有miR396靶位點的MsGRFs基因，通過過表達MIM396基因獲得miR396降低的轉基因植株，評價轉基因植株愈傷組織的再生效率及愈傷組織中MsGRFs基因的表達量，探究miR396-MsGRFs通路調控紫花苜蓿愈傷再生的功能。本研究的實施為提高苜蓿再生效率及打破再生過程中的基因型限制提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫花苜蓿‘中苜1號’植株成熟葉片為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1MsGRFs基因查找及miR396結合位點預測 利用NCBI在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找擬南芥9個GRF蛋白的氨基酸序列，分別為AtGRF1(AT2G22840.1)，AtGRF2(AT4G37740.1)，AtGRF3(AT2G36400.1)，AtGRF4(AT3G52910.1)，AtGRF5(AT3G 13960.1)，AtGRF6(AT2G06200.1)，AtGRF7(AT5G53660.1)，AtGRF8(AT4G24150.1)，AtGRF9(AT2G45480.1)。以擬南芥AtGRFs氨基酸序列為模板，在紫花苜蓿基因庫The Alfalfa Gene Index and Expression Atlas Database(AGED，http://plantgrn.noble.org/AGED/index.jsp)中利用TBLAST在線比對，查找紫花苜蓿MsGRFs基因。利用DNAMAN6.0和MEGA5.0軟件對紫花苜蓿和擬南芥GRF蛋白的氨基酸序列進行比對與進化樹分析。利用免費RNA分析網站miRBase(http://www.mirbase.org/)和RegRNA 2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)對紫花苜蓿GRF基因和miR396的結合位點進行預測。

1.2.2愈傷組織誘導及分化 選取兩株‘中苜1號’紫花苜蓿植株(WT49和WT1)葉片作為外植體，50%次氯酸鈉(NaClO)溶液震蕩漂洗5 min左右，無菌水沖洗5～10次。將消毒處理后的葉片置于愈傷誘導培養基(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，(25±1)℃，暗培養4周。將愈傷組織轉接至分化培養基(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 2 mg·L-1+ KT 0.05 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，16 h光照/8 h黑暗，(25± 1)℃，培養，每2周繼代一次。分別取未分化的愈傷組織及胚性化愈傷組織為樣品，液氮速凍，用于基因表達檢測。

1.2.3基因表達量檢測 Trizol法提取愈傷組織RNA，取1 μg RNA為模板，應用反轉錄試劑盒(RR047，Takara)合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，應用Starlighter SYBR Green qpcr Mix(北京啟衡星生物科技有限公司,FS-Q1002)試劑，qTOWER3G(analytik jena)儀器進行基因表達量檢測。利用2-ΔΔCT方法[20]計算miR396和MsGRFs的表達量。每個處理3個生物學重復，應用SAS9.0軟件進行統計分析。引物信息詳見表1。

表1 基因及引物信息

1.2.4農桿菌介導的遺傳轉化 菌液制備：將已報道的抑制miR396表達的MIM396基因[21]重組至植物表達載體pZH01中導入農桿菌EHA105，潮霉素基因為篩選標記基因。將含有目的基因的農桿菌用YEP培養基(NaCl 10 g·L-1+酵母提取物5 g·L-1+胰蛋白胨10 g·L-1)搖培至OD600≈0.8。菌液3 000 r·min-1離心10 min，用重懸液(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+乙酰丁香酮100 μM，pH值5.4)重懸菌液至OD600至0.5，28℃放置30 min，備用。

農桿菌侵染：以‘中苜1號’紫花苜蓿成熟葉片為外植體，消毒處理后的葉片切為0.5×0.5 cm2左右大小，浸泡于侵染液，負壓處理10 min。然后80 r·min-1搖培浸染20 min，棄菌液。將侵染后的葉片置于含有一層無菌濾紙的共培養基中(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+乙酰丁香酮150 μM +瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，暗培養3天。

篩選培養及分化：將共培養后的植物材料置于篩選培養基(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+特美汀200 mg·L-1+潮霉素10 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH 5.8)，光照培養2周。兩周后將愈傷組織置于添加有200 mg·L-1特美汀和10 mg·L-1潮霉素的分化培養基中進行胚狀體誘導。2周繼代一次。將胚狀體轉接至生根培養基中(MS 2.95 g·L-1+蔗糖15 g·L-1+特美汀200 mg·L-1+潮霉素2 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，16 h光照/8 h黑暗，(25±1)℃培養，直至生長出再生植株。將再生植株移栽移栽至土壤中，置于日光溫室培養。

1.2.5轉基因材料鑒定 以野生型和轉基因抗性紫花苜蓿植株葉片為材料，利用CTAB法提取總DNA，以35 s_F：GAAACCTCCTCGGATTCCATT和MIM396_R：GAGGAATTCACTATAAAGAGAATCG為引物，進行PCR檢測。Trizol法提取植株葉片總RNA。取1 μg RNA為模板，以stem-loop miR396a：GTCGTATCCAGTGCAGG-GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAG-TTC為引物，應用反轉錄試劑盒(RR047，Takara)合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，以miR396_F：CGGCGGTTCCACAGCTTTCTT和miR396_R：GTGCAGGGTCCGAGGT為引物，依據上述方法檢測miR396的表達量。每個處理3個生物學重復，應用SAS9.0軟件進行統計分析。

1.2.6再生效率比較 以野生型紫花苜蓿植株M49-5和轉基因陽性植株M17成熟葉片為外植體。消毒處理后，置于愈傷誘導培養基中，光照培養。培養2周后，取葉片誘導的愈傷組織液氮速凍，用于基因表達檢測。培養4周后，統計總外植體數量及再生出胚狀體的外植體數量，計算分化率(再生外植體數/總外植體數×100%)。每個材料包括2個生物學重復，應用SAS9.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿MsGRFs基因鑒定

以AtGRF蛋白序列為模板，在紫花苜蓿基因組數據庫同源比對獲得9個MsGRFs基因。MsGRFs和AtGRFs蛋白序列構建系統進化樹，發現兩者具有較高的同源性(圖1A)。依據進化關系將MsGRFs命名為：MsGRF1a(contig_6458)，MsGRF1c(contig_6458)，MsGRF1e(contig_55260)，MsGRF3a(contig_100313)，MsGRF3c(contig_20682)，MsGRF4a(contig_68482)，MsGRF5b(contig_100394)，MsGRF7a(contig_100293)，MsGRF9a(contig_106145)。對MsGRFs基因CDS序列中miR396的靶點進行預測。發現6個GRF有zma-miR396c(MIMAT0010076)的靶點，另外3個則有zma-miR396 g×(MIMAT0015351)的靶點，初步確定這些MsGRFs基因為miR396靶基因(圖1B)。

2.2 MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈傷中高表達

為了研究GRF家族基因是否參與調控紫花苜蓿愈傷組織再生，我們分別比較了兩個‘中苜1號’植株胚性愈傷組織(WT49ec和WT1ec)和非胚性愈傷組織(WT49c和WT1c)中MsGRFs的表達(圖1C和1E)。如圖1D所示，在胚性愈傷組織WT49ec中，除MsGRF3a外，其余8個MsGRFs的表達量均顯著高于WT49c。其中，MsGRF1a，MsGRF1c，MsGRF4a和MsGRF9a在WT49ec中的表達量為在WT49c中的5～7倍；MsGRF1e，MsGRF3c和MsGRF5b在WT49ec中的表達量比在WT49c中高20～80倍；在WT49ec中，MsGRF7a的表達量最高，相當于WT49c材料中的600多倍。在WT1ec中，除MsGRF3a和MsGRF4a外，其余MsGRFs的表達量均顯著高于(約為5～20倍)其在WT1c中的表達(圖1F)。以上結果暗示，GRF家族基因可能參與調控紫花苜蓿愈傷組織胚狀體產生。

圖1 紫花苜蓿MsGRFs基因鑒定及表達模式分析

2.3 過表達MIM396轉基因紫花苜蓿的獲得

為了研究MsGRFs對紫花苜蓿愈傷再生效率的影響，我們借助Target mimicry技術降低苜蓿體內miR396的活性(圖2A)。通過農桿菌轉化法，將MIM396基因轉入‘中苜1號’紫花苜蓿中，經PCR檢測獲得7個轉基因陽性株系(圖2B)。選取M49-5和M17為本研究試驗材料，qRT-PCR結果表明轉基因植株M49-5和M17葉片中miR396的含量顯著降低(圖2C)。

圖2 過表達MIM396植物表達載體及轉基因紫花苜蓿分子鑒定

2.4 過表達MIM396轉基因紫花苜蓿愈傷再生率提高

為了研究miR396-MsGRF通路對紫花苜蓿愈傷再生效率的影響，我們以WT，M49-5和M17的成熟葉片為外植體誘導愈傷組織。結果發現，在愈傷誘導培養基(含2,4-D 4 mg·L-1和 6-BA 0.2 mg·L-1)中培養4周后，野生型植株葉片產生愈傷組織，但無胚狀體產生，MIM396轉基因株系葉片產生的愈傷組織直接分化產生胚狀體，分化率達80%以上(圖3)。以上結果表明，抑制miR396活性后可促進愈傷組織分化，并且降低了再生過程中對細胞分裂素的需求。

圖3 野生型(WT)和MIM396過表達植株(M49-5和M17)愈傷分化率檢測

2.5 過表達MIM396紫花苜蓿愈傷中MsGRFs顯著高表達

對WT和M49-5植株成熟葉片誘導2周產生的愈傷組織中MsGRFs的表達量進行檢測。結果如圖4所示，除MsGRF3a外，其余8個MsGRFs的表達在M49-5c中顯著高于其在WTc中的表達。其中，MsGRF3c和MsGRF5b的表達量在M49-5c中超過在WTc中200倍，可能是促進愈傷組織再生的主要GRF基因。

圖4 野生型愈傷組織(WTc)和MIM396植株愈傷組織(M49-5c)中MsGRFs表達模式

3 討論

在植物組織培養過程中，調控培養基中生長素和細胞分裂素的組合及含量是調控愈傷組織再生的主要方法[22]。而建立一個成功的再生體系通常需要針對外植體自身定制植物激素比例及其他影響因素條件，不僅費時費力，而且受基因型限制常導致無法成功[3]。紫花苜蓿具有復雜的遺傳背景，目前僅有十幾個品種對組培再生體系進行了探索，且再生效率較低[3]。如抗逆性強的‘中苜1號’品種，再生及轉化效率不足5%[23]。近年來，人們逐漸認識到通過對外部條件如培養基、外植體、菌株等的優化已很難將苜蓿的再生效率進行大幅度的改良。因此，亟需針對影響植物再生的內在因素進行調控及改良[6]。據報道，利用形態發生基因的表達是克服基因型限制再生這一障礙的有效策略[6,24]。本研究中，我們發現預測的8個miR396靶MsGRFs基因在胚性愈傷中顯著上調，進一步通過抑制紫花苜蓿中miR396表達，從而提高其靶基因MsGRFs表達，可顯著提高紫花苜蓿再生效率。

miR396-GRF通路在促進細胞增殖和生長，調控各器官的生長發育中具有保守性功能[14-15]。近年來研究發現，GRF轉錄因子家族的成員可以用于改進基于器官發生或胚胎發生的遺傳轉化效率[18-19,25]。植物中GRF家族基因多為miR396的靶基因，本研究鑒定了9個含有miR396的MsGRFs基因，并且其中8個在胚性愈傷中顯著高表達。為了研究GRF家族基因在紫花苜蓿再生中的功能，我們過表達了MIM396基因，抑制了轉基因苜蓿中miR396的表達，間接提高了8個MsGRFs的表達量。組培試驗發現，MIM396轉基因植株葉片再生率顯著提高。在小麥中也發現，過表達抗miR396剪切的rGRFs相比過表達GRFs可進一步提高愈傷再生效率[18]。說明miR396-GRF通路參與調控植物再生效率的功能在紫花苜蓿中具有保守性。

一般情況下，紫花苜蓿葉片誘導的愈傷組織通常需要在含有高水平細胞分裂素的培養基中誘導胚狀體產生[23]。而此過程往往需要根據愈傷組織狀態多次調整激素含量，費時費力。以過表達MIM396的植株葉片為外植體，誘導的愈傷組織在含有較高水平生長素的培養基中即可分化出胚狀體，這大大縮短了再生時間。相似的是，過表達GRF4-GIF融合基因的小麥愈傷組織，在不含有細胞分裂素的培養基中即可分化出再生芽[18]。作者推測，這可能是由于GRF-GIF復合物在促進植物細胞增殖的能力有關[26]。

研究表明，一些發育基因的持續過表達導致了植物發育過程中嚴重的生長缺陷，如營養器官和生殖器官的異常發育和不育，如過表達AP2/ERF家族的一種轉錄因子BABY BOOM(BBM)和WUS基因等[27-28]。本研究發現，過表達MIM396轉基因苜蓿雖然顯著提高了葉片愈傷再生效率，但顯著抑制了轉基因植株地上部分的生長。因此，使用這些發育基因仍然需要通過基因切除或使用誘導性或組織特異性啟動子等方法來限制或消除它們在植物中的持續表達[29-30]。因此，如何應用MIM396基因使之促進苜蓿再生的同時不影響植株生長發育仍需進一步研究。

GRF為多基因家族，不同的GRF基因在提高植物再生效率中作用不同[18]。在小麥中含有10個GRF基因，研究者發現GRF4-GIF1和GRF5-GIF1融合表達后可顯著提高小麥的再生效率，其中GRF4-GIF1融合表達后愈傷的再生率最高，而GRF1和GRF9基因分別與GIF1融合表達后對小麥再生效率無顯著影響[18]。但是，在本研究中鑒定獲得的9個MsGRFs基因中，比較其在野生型胚性愈傷組織及MIM396轉基因材料愈傷組織中表達，MsGRF3c，MsGRF5b均顯著高表達，而MsGRF4a雖然也均上調，但上調倍數顯著低于MsGRF5b的表達量。研究發現，擬南芥GRF5(AtGRF5)在愈傷組織細胞中的異位表達加速了芽的形成，顯著提高了轉化效率。AtGRF5和GRF5同源物引入油菜(甘藍型油菜)、大豆和向日葵中，均顯著增加了外植體組織的遺傳轉化。過表達GRF5，AtGRF6和AtGRF9對油菜中轉基因愈傷組織細胞的增殖均有積極作用。在大豆和向日葵中，GRF5基因的過表達似乎增加了轉化細胞的增殖，促進了轉基因芽的形成。此外，兩個AtGRF5同源基因在玉米(ZeamaysL.)中的轉化顯著提高了轉化效率，并獲得了完全可育的轉基因植株[19]。因此我們推測在MIM396轉基因材料中，MsGRF3c和MsGRF5b可能是促進紫花苜蓿再生的重要GRF基因。

4 結論

本研究在紫花苜蓿中鑒定了9個含有miR396靶位點MsGRFs基因，除MsGRF3a外，其余MsGRFs基因均顯著響應愈傷組織胚性化。過表達MIM396基因，間接提高MsGRFs表達，可顯著提高苜蓿葉片的再生效率和速度，消除愈傷組織再生對細胞分裂素的需求。結合靶MsGRFs在胚性與非胚性愈傷組織、MIM396轉基因及野生型愈傷組織間的表達模式，我們推測MsGRF3c和MsGRF5b可能在促進苜蓿再生中起著重要作用。總之，我們明確了miR396-MsGRF通路在苜蓿再生中的重要作用，為提高苜蓿再生效率，并打破基因型對不同苜蓿品種再生的限制提供了候選基因。