SMAD4 基因單核苷酸多態性位點rs12958604 和rs10502913 與宮頸癌相關性研究

滕元姬 凌永嫦 王永亮 李美琴 王春芳 王俊利 楊鳳蓮

在全球范圍內，宮頸癌是女性第四大常見癌癥，每年有50 多萬例女性確診[1]。在中國，宮頸癌是僅次于乳腺癌的女性生殖系統第二大癌癥，其發病原因雖證實與HPV 感染有關，但確切的機制仍不十分清楚[2-3]。SMAD4（mothers against decapentaplegic homolog 4）又名DPC4，是位于人類染色體18q21.1 的腫瘤抑制基因，由12 個外顯子組成，編碼552 個氨基酸序列，是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）通路關鍵的細胞內轉錄因子，其缺失被認為是腫瘤細胞對TGF-β 產生抵抗的開始[4]。研究表明，SMAD4 基因突變與宮頸癌發生發展和不良預后相關，SMAD4 基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與胸主動脈瘤或主動脈夾層、潰瘍性結腸炎、直腸癌、胰腺導管癌等多種腫瘤易感性密切相關[5-6]。本研究旨在通過采用病例對照研究的方法，探討SMAD4 基因SNP 位點rs12958604 和rs10502-913 與宮頸癌易感性的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018 年2 月至2019 年12 月右江民族醫學院附屬醫院和廣西醫科大學附屬腫瘤醫院確診的宮頸癌患者和同時期健康體檢者血液樣本各342 例，分為宮頸癌組和對照組，及包括年齡、民族、腫瘤類型、組織病理分級、腫瘤TNM 分期、是否淋巴結轉移、是否遠處轉移等臨床病理資料。納入標準：宮頸癌組：1）經臨床和病理組織診斷為宮頸癌；2）年齡≥18 歲。對照組：1）健康體檢女性，年齡≥18 歲；2）納入個體間無血緣關系；3）血液常規檢查結果正常及HPV 檢測結果陰性。排除標準：宮頸癌組與對照組：1）既往腫瘤史或合并其他腫瘤；2）合并其他系統性血液或自身免疫類疾病；3）有精神病史、有慢性病史、有腫瘤家族史。本研究獲得右江民族醫學院附屬醫院和廣西醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 研究設計 采用病例對照研究方法，對宮頸癌組和對照組SMAD4 基因SNP 位點rs12958604 和rs10502913 頻率差異進行比較，同時評估其他風險因素對病因的影響。

1.2.2 DNA 提取及 SNP 檢測 收集血液樣本2 mL/例，嚴格按照DNA 提取試劑盒（深圳亞能生物科技有限公司）說明書要求進行實驗操作，提取血液樣本中的DNA，-20°條件保存。采用imLDRTM多重SNP 分型試劑盒（上海天昊生物科技有限公司），使用多重PCR 反應對目標SNP 位點所在區段進行擴增。rs12958604 擴增引物上游為5'-CTAAGCCTTGATGAGTTGCT-3'，下游為5'-CTGCAAATTATATTATAGAT-3'；rs10502913 擴增引物上游為5'-TAGCCAATCCTGACTGATAC-3'，下游為5'-TTGTGCCAAGACCTAGGTTA-3'。采用ABI3730XL毛細管電泳分析擴增產物。

1.3 統計學分析

采用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析。各位點基因型、等位基因（計算方法例數加倍）、基因模型采用二元Logistic 回歸分析，群體遺傳學Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗采用 χ2檢驗，陽性位點與其他風險因素采用多元Logistic 回歸多因素分析，基因單倍型（計算方法例數加倍）采用在線SHEsis 軟件分析。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

宮頸癌組的中位年齡為51（23～79）歲，對照組的中位年齡為50（23～86）歲，兩組年齡進行比較差異無統計學意義（P=0.060）。宮頸癌組中，鱗狀細胞癌最多見，占 78.1%（267/342），其次為腺上皮細胞癌，占15.2%（52/342）。在宮頸癌TNM 分期中（Ⅰ+Ⅱ期）占64.9%（222/342），淋巴結轉移占24.0%（82/342），遠處轉移占6.1%（21/342）。

2.2 基因型分析

SMAD4 基因SNP 位點rs12958604 和rs105029 13 分型顯示，rs12958604 位點有AA、GA 和GG 基因型，rs10502913 位點有GG、GA 和AA 基因型（圖1）。

圖1 SMAD4 基因SNP 位點rs12958604 和rs10502913 測序圖

2.3 基因型和等位基因與宮頸癌易感性分析

采用群體遺傳學Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗基因型頻數，宮頸癌組rs12958604（χ2=0.943，P=0.332）和rs10502913（χ2=3.473，P=0.062）位點基因型符合Hardy-Weinberg 平衡定律；對照組rs12958604（χ2=1.996，P=0.158）和rs10502913（χ2=0.221，P=0.639）位點基因型亦符合。本研究結果顯示，群體的遺傳性能保持相對穩定，各等位基因的頻率在遺傳中基本保持基因平衡。rs12958604 位點GG 基因型、GG+GA 顯性模型在宮頸癌組和對照組進行比較差異均具有統計學意義（均P＜0.05），G 等位基因在宮頸癌組中分布頻率低于對照組，兩組進行比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。rs10502913 位點的基因型和等位基因在兩組中進行比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1，2。

表1 rs12958604 和rs10502913 基因頻率在宮頸癌組與對照組的比較

表2 rs12958604 和rs10502913 等位基因頻率在宮頸癌組與對照組的比較

2.4 rs12958604 和其他風險因素與宮頸癌易感性的多元Logistic 回歸多因素分析

SMAD4 基因SNP 位點rs12958604 和其他風險因素與宮頸癌易感性的多元Logistic 回歸多因素分析結果顯示，高血壓為宮頸癌易感性的獨立危險因素，而年齡、民族、高血脂、糖尿病與宮頸癌易感性進行比較差異均無統計學意義（均P＞0.05，表3）。

表3 rs12958604 和其他風險因素與宮頸癌易感性的多因素分析

2.5 SMAD4 基因SNP 位點 rs12958604 和rs105029-13 單倍型分析

采用SHEsis 軟件進行rs12958604 和rs105029-13 單倍型分析結果顯示，兩組基因有3 種單倍型，分別為A-G、G-A、G-G，其中以G-A 單倍型為主。在宮頸癌組和對照組中，G-A 單倍型分別占50.6%（346/684）和57.9%（396/684），G-A 和G-G 單倍型在兩組中進行比較差異均具有統計學意義（均P＜0.05，表4）。

表4 宮頸癌組和對照組中rs12958604 和rs10502913 單倍型比較

3 討論

SMAD4 是基因編碼信號轉導蛋白SMADs 家族成員。SMAD4 連接激活域并整合WNT、FGF 和TGF-β 信號通路，經過多種途徑被絲氨酸-蘇氨酸受體激酶磷酸化后參與調節TGF-β[4]。TGF-β 通路上游有信號傳遞時，下游區SMAD4 基因可通過增強TGF-β信號來調節靶基因的表達[7]。SMAD4 基因缺失在胰腺導管腺癌中最常見，但也在如胃癌、結腸癌、肺鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中表達[8-9]。

本研究發現，SMAD4 基因 SNP 位點rs129586-04 的GG 基因型和GG+GA 顯性模型及G 等位基因可能降低宮頸癌易感性；rs12958604 和rs10502913 單倍型分析顯示，攜帶G-G 單倍型為風險因素，可能增加宮頸癌易感性，而G-A 單倍型可能降低宮頸癌易感性。本研究的多因素分析結果顯示，高血壓為宮頸癌易感性的獨立危險因素。張璇等[10]對SMAD4 基因SNP 與鼻咽癌預后的相關性研究發現，rs12598604 位點GA/GG 型攜帶者3 年遠處轉移風險增高，而本研究并未發現該位點GA/GG 型與臨床病理特征（遠處轉移、淋巴結轉移）具有相關性，可能與rs12598604在鼻咽和宮頸組織中表達水平不同有關。Alghamdi 等[11]研究顯示，SMAD4 基因在17.6%原發性宮頸腺癌中表達缺失，在95.8%黏液性上皮腫瘤（如宮頸、子宮內膜、卵巢）中表達降低。Yuan 等[12]研究發現，TGF-β 信號通路的上游TGFBR2 調節因子通過Hedgehog 信號失活上調SMAD4 表達，從而抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移。劉堯堯等[13]研究顯示，miR-210-3p 通過靶向調控SMAD4 基因，可提高其蛋白表達水平，從而負向調控宮頸癌Hela 細胞的增殖、侵襲能力。本研究顯示，SMAD4 基因 SNP 位點rs10502913 與宮頸癌易感性無相關性。Zhao 等[14]研究顯示，SMAD4基因SNP 位點rs10502913 與中國漢族人群的煤炭工人塵肺病易感性無相關性。Wosiak 等[15]研究發現，SMAD4 基因SNP 位點rs10502913 與結直腸癌易感性無顯著相關性。因此，SMAD4 基因無論是在TGFβ 信號通路中的連接、傳遞作用，還是與上、下游基因的相互調控作用，或是自身高度基因SNP，對細胞生長、增殖、分化等均起著不同的重要作用。

綜上所述，本研究結果顯示SMAD4 基因SNP 位點rs12958604 與宮頸癌易感性具有相關性。rs105029-13 與宮頸癌易感性不具有相關性，但該結果仍需更大樣本量和更深層次的研究來進一步證實。本研究也存在如樣本例數較少，未探討區域環境因素與宮頸癌發生是否存在交互作用，缺乏對該基因在宮頸癌組織和癌旁組織樣本中探討等不足之處。擴展SMAD4 基因SNP 領域的數據是本課題未來研究的目的和方向，對臨床早期診斷、個性化治療將具有參考意義。SMAD4 基因與腫瘤相關性研究雖取得了一定進展，但仍處于起始階段，其在腫瘤的早期診斷、預后和治療中仍有較大研究價值。