mTOR激酶抑制劑依賴Bim誘導(dǎo)MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞死亡*

羅哲嬋，鄒勝澤

(浙江省溫州市中醫(yī)院藥劑科 325000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例,已超越肺癌成為全球最高發(fā)病率的癌種。在我國(guó)，乳腺癌發(fā)病率和病死率僅次于肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌，是威脅女性生命健康的重大疾病[1]。因此，臨床迫切需要更高效的治療方案以提高乳腺癌患者的生存率與生存質(zhì)量。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，乳腺癌藥物治療的響應(yīng)率顯著提升，其中特別典型的就是以抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)為代表的靶向治療[2]。HERA和NOAH臨床試驗(yàn)提示，曲妥珠單抗治療后乳腺癌患者的中位生存期可長(zhǎng)達(dá)40.8個(gè)月[3-4]。CLEOPATRA研究結(jié)果進(jìn)一步表明，在曲妥珠單抗聯(lián)合多西他賽的基礎(chǔ)上，帕妥珠單抗能夠?qū)⒅形豢偵嫫谠黾?6個(gè)月[5]。盡管如此，我國(guó)的靶向藥物研發(fā)和管線藥物仍較匱乏。

乳腺癌的分子分型在很大程度上幫助臨床醫(yī)生確立了規(guī)范化的治療方案，為精準(zhǔn)治療提供了依據(jù)。目前乳腺癌根據(jù)基因背景可分為4種亞型：腺腔A型、腺腔B型、HER2過(guò)表達(dá)型和基底樣型[6-7]。其中，HER2過(guò)表達(dá)型乳腺癌占近20%，其惡性程度高，易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移且預(yù)后較差[8]。盡管基于HER2的靶向治療響應(yīng)率高、療效確切，然而出現(xiàn)耐藥的情況也多見(jiàn)[9]。其中，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路的活化是關(guān)鍵的耐藥機(jī)制[10]。BOLERO-3研究結(jié)果提示，mTOR變構(gòu)抑制劑依維莫司可逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗的耐藥性[11]。其實(shí)不僅僅局限在耐藥狀態(tài)下，mTOR通路的異常活化在乳腺癌中也高頻率發(fā)生，是研究的熱門靶點(diǎn)。

mTOR在生物體內(nèi)以2種復(fù)合物的形式存在：mTORC1和mTORC2，它們分別介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能[12-13]。依維莫司是mTOR變構(gòu)抑制劑，主要抑制mTORC1的功能，無(wú)法全盤抑制mTOR信號(hào)通路，并且應(yīng)用后可通過(guò)p70S6激酶1-胰島素受體底物1(S6K1-IRS1)進(jìn)行負(fù)反饋而活化細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇肌酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，治療窗有限[14]。基于此研發(fā)的mTOR激酶抑制劑可全盤抑制mTOR通路，臨床前研究結(jié)果提示抗腫瘤活性優(yōu)于依維莫司或雷帕霉素[15]。我國(guó)經(jīng)濟(jì)目前也躋身于國(guó)際先進(jìn)行列，新型mTOR激酶抑制劑MTI-31已進(jìn)入臨床研究階段[16]。本研究擬明確MTI-31對(duì)HER2過(guò)表達(dá)和基底樣乳腺癌細(xì)胞的作用并初步探究其藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

MTI-31(貨號(hào)：BCP36715)、雷帕霉素(貨號(hào)：BCP01404)和拉帕替尼(貨號(hào)：BCP01815)購(gòu)自瀚翔生物科技公司。多西他賽(貨號(hào)：MB1081)購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司。吐溫-80(Tween-80,貨號(hào)：P1754)，麗春紅(貨號(hào)：P3504)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，貨號(hào)：21904)和二甲基亞砜(DMSO，貨號(hào)：D8418)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。精密稱定MTI-31、雷帕霉素、拉帕替尼和多西他賽適量，加入一定體積的DMSO溶液配置成20 mmol/L的儲(chǔ)備液，渦旋混合均勻后分裝并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩D Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：356234)購(gòu)自美國(guó)BD公司。shBim1和shBim2的序列分別為：5′-TAC ACA AAA TCC TGC TCC A-3′、5′-ATC TCT GGG CGC ATA TCT G-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胎牛血清(貨號(hào)：AQ-mv-09900)購(gòu)自美國(guó)Analysis Quiz公司。青霉素-鏈霉素(貨號(hào)：15140163)和丙酮酸鈉(貨號(hào)：11360070)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；HCC1806購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。MDA-MB-453培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素和丙酮酸鈉)；HCC1806則培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)中。細(xì)胞放置于Eppendorf CellXpertC170i CO2培養(yǎng)箱，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，根據(jù)需求調(diào)整傳代倍數(shù)。

1.3 異種移植瘤模型的建立與給藥方案

訂購(gòu)5～6周齡BALB/c雌性裸鼠，并在無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。復(fù)蘇并培養(yǎng)MDA-MB-453和HCC1806，用無(wú)血清培養(yǎng)基配置一定濃度的細(xì)胞懸液(MDA-MB-453需要1∶1添加基質(zhì)膠)，并皮下注射200 μL制備好的細(xì)胞懸液(MDA-MB-453，7×106個(gè)細(xì)胞/瘤塊；HCC1806，5×106個(gè)細(xì)胞/瘤塊)。根據(jù)公式： 計(jì)算獲得瘤體積并分組(每組小鼠數(shù)量≥5只)。

利用0.5 %的CMC-Na溶劑配置MTI-31溶液，按照40 mg/kg的劑量每天灌胃1次。分別取等體積的無(wú)水乙醇和Tween-80混合后渦旋振蕩，配制成含50%無(wú)水乙醇及50%Tween-80(v/v)的溶液；保存于4 ℃冰箱備用。每次給藥前，稱取適量的多西他賽加入適量體積的上述溶劑渦旋振蕩，使藥物完全溶解，再加入適量體積生理鹽水，渦旋振蕩，使液體混合均勻，乙醇和Tween-80終濃度均為12.5%，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照15 mg/kg的劑量尾靜脈注射給藥，每周1次。給藥前量取瘤塊體積，并對(duì)小鼠進(jìn)行稱重。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)法

利用NuPAGELDS(貨號(hào)：NP0007)制備蛋白樣品，然后經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，隨后采用電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后利用麗春紅染色，觀察蛋白上樣量，之后用TBST溶液漂洗。配置5%脫脂奶粉，于室溫條件下封閉1～2 h。根據(jù)抗體說(shuō)明書，按照比例稀釋抗體[抗體Cleaved PARP(貨號(hào)：5652)和Bim(貨號(hào)：2933S)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，GAPDH(貨號(hào)：AP0063)購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司]并于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST溶液漂洗3次后，用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號(hào)：BS13278,購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司)在室溫孵育2 h。TBST漂洗之后，利用化學(xué)發(fā)光試劑盒，在Bio-Rad成像儀中曝光，獲取條帶數(shù)據(jù)。

1.5 免疫組織化學(xué)

取新鮮瘤組織浸沒(méi)在4%的中性多聚甲醛中，經(jīng)脫水、包埋和切片后，獲取厚度為4 μm的切片。隨后進(jìn)行抗原修復(fù)，配置5%的BSA溶液室溫封閉1～2 h。之后一抗4 ℃孵育過(guò)夜。復(fù)溫后，孵育二抗，之后利用DAB反應(yīng)液進(jìn)行顯色，并用蘇木素進(jìn)行復(fù)染。最后利用萊卡顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MTI-31對(duì)MDA-MB-453異種移植瘤的影響

在MDA-MB-453異種移植瘤模型中，當(dāng)平均瘤體積達(dá)到(488.34±41.90)mm3時(shí)開(kāi)始給藥，并分為3組，MTI-31組1、多西他賽組1、對(duì)照組1(灌胃無(wú)水乙醇和Tween-80溶劑)。在初次給藥后的第4、8天，MTI-31組1與對(duì)照組1瘤體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；到第11天MTI-31組1瘤體積降至(175.13±16.01)mm3。多西他賽組1與MTI-31組1的療效相近，盡管在給藥后的第4天多西他賽組1瘤體積與對(duì)照組1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是到第8天時(shí)多西他賽組1瘤體積與對(duì)照組1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第11天時(shí)多西他賽組1進(jìn)一步縮減至(154.21±14.16)mm3。為了明確多西他賽與MTI-31的聯(lián)合效應(yīng)，當(dāng)對(duì)照組1瘤體積長(zhǎng)到(561.92±72.79)mm3時(shí)聯(lián)合給予2種藥物(聯(lián)合組)。給藥后第3天聯(lián)合組瘤體積迅速縮減至(358.31±53.01)mm3。在給藥期間各組小鼠的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 MTI-31對(duì)HCC1806異種移植瘤的影響

MTI-31和多西他賽在HCC1806異種移植瘤中的作用與MDA-MB-453相比呈現(xiàn)明顯區(qū)別。當(dāng)小鼠瘤體積達(dá)到(486.37±66.71)mm3時(shí)開(kāi)始給藥，將細(xì)胞分為3組，MTI-31組2、西他賽組2、對(duì)照組2(灌胃無(wú)水乙醇和Tween-80溶劑)；MTI-31組2瘤體積的生長(zhǎng)在第3、5天明顯放緩，但到第7天時(shí)較給予前增長(zhǎng)了31.74%(P<0.01)。多西他賽組2的整體趨勢(shì)與MTI-31組2相近，在第7天時(shí)MTI-31組2、西他賽組2分別與對(duì)照組2比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05或0.01)。給藥期間，對(duì)照組2小鼠的體重相對(duì)穩(wěn)定，末次給藥時(shí)MTI-31組2的小鼠體重較給藥前降低明顯(23%，P<0.01)；多西他賽組2則降低了16%(P<0.05)。見(jiàn)圖2。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取MDA-MB-453為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

A：瘤體的體積；B：小鼠的體重；a:P<0.05；b:P<0.01，與對(duì)照組1比較。

A：瘤體的體積；B：小鼠的體重；a：P<0.05；b：P<0.01；c：P<0.001，與對(duì)照組2比較。

2.3 Bim介導(dǎo)MDA-MB-453的凋亡性死亡

2.3.1MTI-31誘導(dǎo)MDA-MB-453死亡依賴于Bim

為了進(jìn)一步研究MTI-31誘導(dǎo)MDA-MB-453異種移植瘤消退的分子機(jī)制，筆者在體外利用細(xì)胞進(jìn)行研究。利用shBim1和shBim2構(gòu)建Bim敲減的MDA-MB-453，細(xì)胞分為shNT組(無(wú)意義序列)、shBim1組、shBim2組，隨后進(jìn)一步分別給予溶劑(DMSO)、MTI-31(5 μmol/L)、雷帕霉素(1 μmol/L)、拉帕替尼(5 μmol/L)和多西他賽(1 μmol/L)。shNT組與各藥物共孵育72 h后，MTI-31、拉帕替尼和多西他賽誘導(dǎo)MDA-MB-453，細(xì)胞分別死亡了(47.0±9.2)%、(83.0±3.3)%和(46.0±3.3)%，然而雷帕霉素僅抑制細(xì)胞的增殖(67.0±25.7)%。其中，MTI-31處理的shBim2組細(xì)胞死亡較MTI-31處理的shNT組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而MTI-31處理的shBim1組細(xì)胞死亡較MTI-31處理的shNT組減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選shBim2作為MDA-MB-453的干擾序列。

a：P<0.05;b：P<0.001，與各系藥物的shNT組比較。

2.3.2敲減Bim后MTI-31誘導(dǎo)的凋亡生物標(biāo)志物Cleaved-PARP明顯減少

將MDA-MB-453分為2組：shNT組和shBim2組，然后分別用溶劑和MTI-31(5 μmol/L)處理。給予DMSO處理的shNT、shBim2組Bim、Cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平無(wú)變化(P>0.05)；給予MTI-31處理的shBim2組Cleaved-PARP和Bim表達(dá)水平均較shNT組明顯降低(P<0.05)，結(jié)果提示敲減Bim后可逆轉(zhuǎn)MTI-31引起的MDA-MB-453細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖4。

A:Western blot;B:光密度定量分析；a：P<0.01。

2.3.3MTI-31可誘導(dǎo)MDA-MB-453異種移植瘤表達(dá)Bim

MDA-MB-453異種移植瘤模型MTI-31給藥11 d后，取瘤塊并利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bim的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MTI-31處理組的瘤組織中Bim表達(dá)較DMSO處理組明顯增加，見(jiàn)圖5。

圖5 MTI-31可誘導(dǎo)MDA-MB-453皮下瘤表達(dá)Bim

3 討 論

MDA-MB-453的基因背景為PIK3CA突變，同時(shí)是HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞[17]。HCC1806的PI3K屬野生型且不表達(dá)HER2[18]。這兩類細(xì)胞分別代表了臨床分子分型為HER2高表達(dá)和基底樣的乳腺癌。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用mTOR激酶抑制劑MTI-31后，MDA-MB-453異種移植瘤出現(xiàn)消退，這種作用與當(dāng)前的一線化療藥物多西他賽相近。HER2高表達(dá)情況下，其下游的PI3K/Akt/mTOR通路被激活。同時(shí)，PIK3CA突變狀態(tài)下mTOR信號(hào)通路也異常活化。因此MDA-MB-453乳腺癌對(duì)mTOR激酶抑制劑的響應(yīng)較好，很大程度上取決于它對(duì)mTOR信號(hào)的依賴性。對(duì)HCC1806來(lái)說(shuō)，其生存與生長(zhǎng)不依賴于mTOR信號(hào)通路。因此，MTI-31作用于HCC1806移植瘤僅體現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制作用。PIK3CA和HER2過(guò)表達(dá)與mTOR激酶抑制劑的療效密切相關(guān)。

在MDA-MB-453中，雷帕霉素僅抑制其生長(zhǎng)。雷帕霉素是經(jīng)典的mTOR變構(gòu)抑制劑，可顯著阻斷mTORC1的功能，通過(guò)抑制基因的轉(zhuǎn)錄最終實(shí)現(xiàn)阻礙細(xì)胞增殖的作用。而MTI-31全盤抑制mTOR通路包括mTORC1和mTORC2，既具有抑制mTORC1而產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制作用，又具有阻斷mTORC2的特有生物學(xué)效應(yīng)。特別是mTORC2，由于在細(xì)胞代謝、生存中起重要作用，已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[19-20]。Bim是細(xì)胞凋亡相關(guān)性蛋白，有文獻(xiàn)已明確其在拉帕替尼和多西他賽誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡中的關(guān)鍵作用[21-22]。通過(guò)特異性敲減Bim可顯著減弱MTI-31及對(duì)照藥物的療效。結(jié)果提示mTORC2/Bim軸與MDA-MB-453的生存有關(guān)。有文獻(xiàn)提示在乳腺癌中mTORC2可活化Akt進(jìn)而調(diào)控FOXO3a Thr32位點(diǎn)的磷酸化[23]。同時(shí)，也有研究指出FOXO3a調(diào)控Bim介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[24]。因此，mTOR激酶抑制劑誘導(dǎo)MDA-MB-453乳腺癌凋亡的機(jī)制很可能是通過(guò)mTORC2/FOXO3a/Bim實(shí)現(xiàn)的，但是有待進(jìn)一步研究確證。

mTOR激酶抑制劑可誘導(dǎo)MDA-MB-453異種移植瘤的消退，但僅抑制HCC1806異種移植瘤的生長(zhǎng)。其療效與多西他賽相當(dāng)。在體內(nèi)和體外，MTI-31、拉帕替尼和多西他賽均能誘導(dǎo)MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞凋亡性死亡，且其作用與誘導(dǎo)Bim表達(dá)有關(guān)。