黃瓜耐濕冷性苗期綜合評價預(yù)測方程的建立

丁圓圓，王曦奧，劉策，李淑菊，程智慧*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 咸陽 712100；2.天津科潤黃瓜研究所，天津 300192）

黃瓜（Cucumis sativusL.）屬于葫蘆科一年蔓生草本植物，起源于亞熱帶，溫度低于10℃可對其造成傷害，低于5℃造成植株死亡[1]。秋冬和冬春設(shè)施栽培中，低溫和高濕是影響黃瓜生長的主要逆境。低溫影響黃瓜種子萌發(fā)、葉片光合作用及產(chǎn)量和品質(zhì)形成，持續(xù)低溫甚至造成植株死亡，不同黃瓜品種對低溫脅迫的敏感性不同[2]。一般認(rèn)為，黃瓜生長喜好較高空氣濕度，短時間在95%~100%濕度下也能正常生長，但持續(xù)時間過長易導(dǎo)致病害發(fā)生[3]。且高濕環(huán)境特別是光照不足情況易造成植株徒長。研究表明，空氣濕度與植株同化物的生產(chǎn)、積累和分配顯著相關(guān)[4-7]；濕度過大，葉綠素含量顯著降低[8]；葉片氣孔開度隨空氣濕度的增加而增大，但濕度過高會導(dǎo)致氣孔收縮和開度減小[9-10]。

溫度和濕度是2個相互影響的重要環(huán)境因子，影響植物葉片生長、氣孔開度和蒸騰速率。王慧等[11]基于葉溫和空氣濕度的關(guān)系建立了黃瓜病害預(yù)測模型，能準(zhǔn)確預(yù)測霜霉病的發(fā)病時間。Gu等[12]研究表明，高溫高濕處理后，大豆種子蛋白質(zhì)和油脂含量更高。徐超等[13]研究表明，高溫脅迫后增加空氣濕度可顯著提高番茄葉片的蒸騰速率和凈光合速率，有效緩解高溫脅迫。但濕冷對黃瓜生長發(fā)育影響的研究尚未見報道。

植物抗性鑒定的指標(biāo)和方法較多，從1個或2個指標(biāo)出發(fā)，局限性較大，無法準(zhǔn)確地反映植物的實際耐性。指標(biāo)太多、相互關(guān)聯(lián)、信息大量重疊，又會導(dǎo)致問題復(fù)雜化。通過主成分分析，將多個指標(biāo)簡化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)，可簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，盡量多地反映原來變量的信息，如運用主成分分析對甘蔗抗旱性[14]和杏抗寒性[15]進(jìn)行評價。隸屬函數(shù)法也在植物抗性評價中廣泛應(yīng)用，如苜蓿耐旱性[16]、楊樹耐寒性[17]和紫莖澤蘭耐熱性[18]研究等。因子分析法從整體上進(jìn)行分析研究，但無法對各公因子給出合理的解釋，因此需要根據(jù)研究目的選擇聚類方法，柴守璽[19]對小麥耐旱性進(jìn)行研究認(rèn)為，用原始數(shù)據(jù)模糊聚類法得出的分類結(jié)果最為理想。周廣生等[20]先采用主成分分析將多個單項指標(biāo)綜合成少數(shù)幾個新的相互獨立的綜合指標(biāo)，再利用隸屬函數(shù)法得出各品種的耐濕綜合評價值，利用綜合評價值與單項指標(biāo)建立最優(yōu)回歸方程來預(yù)測小麥品種的耐濕性。目前，關(guān)于黃瓜耐濕冷性鑒定的研究尚未見報道。因此，本研究基于育種和栽培實際需要，在人工氣候箱設(shè)置濕冷環(huán)境處理，從形態(tài)、生理等方面篩選可用于黃瓜苗期濕冷性鑒定的指標(biāo)，利用生物數(shù)學(xué)方法建立苗期耐濕冷性預(yù)測方程，旨在為黃瓜耐濕冷育種和栽培提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料及育苗

選用20份不同耐濕冷性的品種（表1）為試材。其中，13份用于建立耐濕冷性預(yù)測方程；另7份用于驗證預(yù)測方程。將供試種子（有種衣劑的先洗去種衣劑）室溫下浸種4 h，然后放入28℃恒溫箱中，黑暗環(huán)境催芽至種子露白，播入裝有育苗基質(zhì)的50孔穴盤，置于人工氣候室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：晝/夜溫度25℃/18℃，空氣相對濕度85%，光周期12 h/12 h，白天光照強度16 000 lx（250 μmol·m?2·s?1)。待子葉展開后，移栽于營養(yǎng)缽（8 cm×8 cm），培養(yǎng)至供試大小。

表1 供試材料信息Table 1 Information of test materials 續(xù)表Continued

表1 供試材料信息Table 1 Information of test materials

1.2 濕冷處理

幼苗長至2片真葉展開后開始進(jìn)行試驗。人工氣候箱濕冷處理條件為：晝/夜溫度9℃/5℃、空氣相對濕度95%、光周期12 h/12 h、白天光照強度16 000 lx（250μmol·m?2·s?1）。待箱內(nèi)條件達(dá)到設(shè)定值后，將生長一致的黃瓜幼苗移入培養(yǎng)箱進(jìn)行處理；以晝/夜溫度25℃/18℃、空氣相對濕度85%、光周期12 h/12 h、白天光照強度16 000 lx（250μmol·m?2·s?1）為對照。每處理3次重復(fù)（3個人工氣候箱），每重復(fù)25苗。處理3 d后隨機選取5株測定有關(guān)指標(biāo)，計算平均值。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)株高（seedling height，SH）：用直尺測量子葉節(jié)處至生長點距離；莖粗（stem diameter，SD）：用游標(biāo)卡尺在子葉節(jié)下1 cm測量2次直徑，取均值；葉長（leaf length，LL）：用直尺測量從上往下第2片真葉的最大葉長。

1.3.2 生理指標(biāo)過氧化氫酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的活性及谷胱甘肽（glutathione，GSH）、脯氨酸（proline，Pro）、可溶性糖（soluble sugar，SS）、超氧陰離子（superoxide anion，)的含量均參照曹翠玲等[21]方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用性狀相對值進(jìn)行耐濕冷性評價。采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、主成分分析、相關(guān)分析、逐步回歸和聚類分析。參照李合生[22]的方法計算相關(guān)指標(biāo)，計算公式如下。

隸屬函數(shù)值U(Xj)：指標(biāo)與耐濕冷性呈正相關(guān)采用公式（2）；指標(biāo)與耐濕冷性呈負(fù)相關(guān)采用公式（3）。

式中，Xj表示第j個綜合指標(biāo)，Xmax表示第j個綜合指標(biāo)最大值，Xmin表示第j個綜合指標(biāo)最小值，j=1，2，…，n。

式中，Wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中重要程度；Pj為各品種第j個綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率，j=1，2，...，n。

耐濕冷性綜合評價值（Dj）。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕冷對不同黃瓜品種形態(tài)和生理指標(biāo)的影響

濕冷處理后，測定各品種較對照的相對指標(biāo)，結(jié)果（表2）顯示，13個品種的相對株高、相對莖粗和相對葉長均小于1，表明濕冷處理抑制了幼苗的生長和物質(zhì)積累，其中，品種Syz、Sy4和Msjp313的SH、SD和LL的相對值在13個品種中較低，即這3個品種的耐濕冷能力較弱；品種Bn5、Jy1和Jy64各形態(tài)指標(biāo)的相對值較高，即這3個品種的耐濕冷能力較強。濕冷處理3 d后，所有品種的含量升高，其中，品種Sy4的增量最多，表明植株受損傷較嚴(yán)重；品種Jy64和Jy1變化較小，相對值接近1，表明植株受損傷較小。為緩解濕冷處理造成的過氧化傷害，抗氧化酶活性增大，抗氧化物含量升高，其中，品種Jy64和Jy1顯著升高；但品種Syz和Ymt2188在濕冷處理3 d后抗氧化酶活性降低，表明其自我調(diào)節(jié)能力較低，濕冷脅迫嚴(yán)重影響了植株的生理機能。濕冷處理后，Pro和SS含量也有所增加，其中，品種Bn5的滲透調(diào)節(jié)物含量顯著高于其他品種。相對指標(biāo)中，生理指標(biāo)的變幅（24.52%~52.00%）明顯大于形態(tài)指標(biāo)（6.90%~12.31%），因此，需要用多元統(tǒng)計分析綜合評價黃瓜品種的耐濕冷性。

表2 濕冷處理下不同黃瓜品種各指標(biāo)的相對值Table 2 Relative values of different indexes under wet-cold treatment of different cucumber varieties

2.2 不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析

對10個相對指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果（表3）表明，相對SH、SD、LL與相對GSH含量呈顯著正相關(guān)，且均與CAT相對活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；相對PAL活性與相對PPO活性呈極顯著正相關(guān)，與相對GSH含量呈顯著負(fù)相關(guān)；相對PPO活性與相對GSH含量呈顯著負(fù)相關(guān)；相對O-2含量與相對GSH、Pro含量及相對SH呈顯著負(fù)相關(guān)；相對GSH含量與相對Pro含量呈顯著正相關(guān)；相對Pro含量與相對SD、SH呈極顯著正相關(guān)。綜上表明，10個指標(biāo)間信息有所重疊。

表3 10個耐濕冷鑒定指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of 10 wet-cold tolerance identification indexes

2.3 耐濕冷性不同指標(biāo)的主成分分析

對13個品種10個苗期指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，共獲得4個主成分（表4），其貢獻(xiàn)率分別為36.6%、17.8%、14.3%和12.2%，累 計 貢 獻(xiàn) 率80.9%，具有較強的信息代表性。其中，第1主成分主要由形態(tài)指標(biāo)構(gòu)成，相對株高的特征向量最大，為0.876；第2主成分主要由相對GSH含量和PAL活性構(gòu)成，其中，相對GSH含量的特征向量為0.784；第3主成分主要由相對CAT活性和PPO活性構(gòu)成，其中，相對CAT活性的特征向量為0.623；第4主成分主要由相對含量和SS含量構(gòu)成，其中，相對含量的特征向量為0.572。

表4 主成分分析及特征值Table 4 Principal component analysis and eigenvalue

2.4 耐濕冷性綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)分析及權(quán)重的確定

根據(jù)4個主成分的特征向量以及各單項指標(biāo)相對值求出每個品種的綜合指標(biāo)值X1、X2、X3和X4，以這4個綜合指標(biāo)（表5）為耐濕冷性評價的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，利用公式（2）和公式（3）計算各品種的隸屬函數(shù)值（U）。隸屬函數(shù)值可作為黃瓜耐濕冷性的量度值，初步評價黃瓜品種的耐濕冷性。針對某一綜合指標(biāo)，其U值越大，表明品種在此綜合指標(biāo)中的耐濕冷性越強。對于X1，Bn5的隸屬函數(shù)值U（X1）最大，為0.666，其耐濕冷性最強；Msjp313的隸屬函數(shù)值U（X1）最小，為0.350，其耐濕冷性最弱；對于綜合指標(biāo)X2、X3和X4，Syz材料的

U（X2）、U（X3）、U（X4）低于其他品種，均在0.300左右，表明其耐濕冷性較弱。根據(jù)各綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率，利用公式（4）計算出4個綜合指標(biāo)的權(quán)重，分別為0.446、0.223、0.179和0.152。

2.5 黃瓜品種耐濕冷性的綜合評價及聚類分析

耐濕冷性綜合評價值（D）能反映出各個品種的綜合耐濕冷能力，D值越大表示其耐濕冷性越強。根據(jù)各品種各綜合指標(biāo)的U值和權(quán)重，利用公式（5）計算各品種的耐濕冷性綜合評價值D。結(jié)果（表5）表明，13個品種D值的變幅為0.300~0.700，其中，品種Bn5的D值最大，表明其耐濕冷性最強；Syz的D值最小，表明其耐濕冷性最弱。根據(jù)D值對13個品種的耐濕冷性由強到弱排序為：Bn5、Jy64、Jy1、Jyys、Ccmc、Zn26、Ymt2188、QsF1、FyF1、Hl35、Sy4、Msjp313、Syz。

表5 各品種評價指標(biāo)及綜合排序Table 5 Index of each variety and ranking

基于D值，對13個黃瓜品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖1）表明，距離為3時，13個品種可分為4類：第Ⅰ類包含Jy64、Bn5和Jy1，D值平均約為0.6，為強耐濕冷型；第Ⅱ類包含Jyys、Ccmc、Zn26、Ymt2188、FyF1和QsF1，D值平均約為0.5，為中耐濕冷型；第Ⅲ類包含Sy4和Hl35，D值平均約為0.4，為弱耐濕冷型；第Ⅳ類包含Syz和Msjp313，D值平均約為0.3，為濕冷敏感型。

圖1 13個黃瓜品種耐濕冷性聚類分析結(jié)果Fig.1 Cluster analysis of 13 cucumber varieties based on D value

2.6 黃瓜耐濕冷性苗期預(yù)測方程的建立及驗證

為揭示各指標(biāo)與耐濕冷性的關(guān)系，篩選可靠評價指標(biāo)，建立有效評價數(shù)學(xué)模型，以13個黃瓜品種的各單項指標(biāo)相對值為自變量，D值為因變量，通過逐步回歸剔除不顯著自變量，建立最優(yōu)回歸方程（式6），由方程可知，相對CAT活性、相對Pro含量和相對PPO活性這3個指標(biāo)對黃瓜耐濕冷性影響顯著，可用于黃瓜耐濕冷性的鑒定。

式中I4、I6和I7分別為相對CAT活性、相對Pro含量和相對PPO活性。

為驗證預(yù)測回歸方程，以另外7個檢測品種10個單項指標(biāo)實測的相對值（表6）代入相關(guān)公式，計算D值。同時將相對CAT活性、相對Pro含量和相對PPO活性代入回歸方程算得7個檢測品種的耐濕冷性預(yù)測值。比較7個黃瓜品種耐濕冷性綜合評價值（D）和耐濕冷性預(yù)測值（P），結(jié)果（表7）表明，7個品種耐濕冷性預(yù)測準(zhǔn)確度均在93.0%以上，平均94.9%。7個品種的耐濕冷性預(yù)測值排序結(jié)果從大到小為：Zn28、Jy4、Drt8-9F、Rg2、Jy35、Jy41、Sy11；與D值排序結(jié)果基本吻合，且二者相關(guān)系數(shù)為0.975，達(dá)到顯著水平，證明所建數(shù)學(xué)模型可用于黃瓜苗期耐濕冷性評價。

表6 7個驗證品種10項指標(biāo)的實測相對值Table 6 Relative values of indexes of 7 tested varieties

表7 回歸方程的估計準(zhǔn)確度Table 7 Evaluation accuracy of equation

3 討論

本研究表明，濕冷處理后植株生長受到抑制，各形態(tài)指標(biāo)的相對值均小于1；耐濕冷性較強品種與較弱品種的葉長、株高和莖粗均存在顯著差異，且這3個指標(biāo)相關(guān)顯著，與前人研究結(jié)果一致[23]。在黃瓜耐冷性研究中，用各性狀的絕對值進(jìn)行耐冷性比較，無法消除不同品種本身差異的影響[24]，因此，本研究采用各指標(biāo)脅迫處理與對照的相對值進(jìn)行比較分析。濕冷處理不僅抑制了黃瓜生長，還引起O-2的累積，與前人研究結(jié)果一致[25]。濕冷處理下，CAT、PAL和PPO活性增強，抗氧化物GSH含量也明顯升高，說明抗氧化系統(tǒng)在黃瓜抗?jié)窭溥^程中發(fā)揮了重要作用。有研究表明，Pro和SS有利于維持生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，與植物耐冷性呈正相關(guān)關(guān)系[26]；本研究表明，各品種濕冷處理后Pro含量均上升，可能與黃瓜耐冷性密切相關(guān)。

濕冷作為復(fù)合逆境更加復(fù)雜化。張紅穎等[28]采用5個芽期指標(biāo)對不同玉米自交系的耐冷性進(jìn)行了鑒定評價；鄭昀曄等[29]認(rèn)為，相對發(fā)芽率與相對幼苗干重能夠較好地反映品種的抗寒性。本研究表明，10個性狀指標(biāo)從不同角度反映了黃瓜幼苗的耐濕冷性，但提供信息有重疊。因此，直接利用各單項指標(biāo)不能有效地評價黃瓜品種的耐濕冷性，利用多元統(tǒng)計和綜合分析[27]，篩選簡捷和準(zhǔn)確的耐濕冷性評價指標(biāo)，有利于建立黃瓜耐濕冷性評價體系。近年來，越來越多學(xué)者采用主成分分析、隸屬函數(shù)法、灰色關(guān)聯(lián)度等方法綜合評價植物的抗逆性，但忠等[30]用逐步回歸建立了黃瓜耐熱性預(yù)測方程。本研究通過主成分分析將相對株高、相對莖粗和相對葉長等10個指標(biāo)轉(zhuǎn)換成為4個綜合指標(biāo)，建立了黃瓜耐濕冷性預(yù)測的最優(yōu)回歸方程，篩選出相對CAT活性、相對Pro含量和相對PPO活性3個受濕冷影響顯著的指標(biāo)，不僅消除了指標(biāo)信息重疊影響鑒定準(zhǔn)確性的問題，也簡化了指標(biāo)的鑒定工作，為黃瓜耐濕冷性育種提供了技術(shù)支持。